毒性中药天仙子有效成分的液相色谱一质谱法定性定量分析应用文献

四川大学学报(医学版)2010年第41卷第1期154 155 深圳市高比科技有限公司联系人：水先生电话：13810737909邮箱：water1102@163.com 网址：www. globetechchina. com 四川大学学报(医学版)2010；41(1)：153-157 J Sichuan Univ (Med Sci Edi) HPLC-MS/MS 测定大鼠血浆及组织中盐酸戊乙奎醚浓度 余 勤，梁茂植^，南 峰，向 瑾，秦永平 四川大学华西医院 GCP中心临床药理研究室(成都610041) 【摘要】 目的 建立用高效液相色谱质谱联用(HPLC-MS/MS)技术测定大鼠血浆、脑组织及肺组织中戊乙奎醚浓度的方法。方法 大鼠血浆、脑组织及肺组织样品中戊乙奎醚及内标苯海苯明经石油醚：乙醚(70：30)提取后，采用 HPLC-MS/MS 技术进行测定。以Allure C18(50×2.1 mm， 5 um)为色谱柱，以甲醇：5 mmol/L 醋酸胺：三乙胺=90：10：0.05(甲酸调pH5.8)为流动相进行分离，检测离子为质荷比(m/z)316.2/128.3(戊乙奎醚)，256.3/167.1(内标)。结果 标准曲线线性范围为血浆0.391~200 ng/mL，脑组织及织组织0.391~100 ng/mL。预处理回收率为血浆67.32%~70.80%，肺组织84.99%~89.27%，脑组织76.86%~81.98%；方法回收率为血浆97.66%~99.97%，肺组织96.55%~101.65%，脑组织95.18%~100.21%；日内精密度 RSD分别为：血浆1.94%~2.93%，肺组织1.73%~3.70%，脑组织2.35%~2.79%；日间精密度 RSD分别为：血浆3.00 %~3.85%，肺组织2.86%~3.94%，脑组织2.77%~5.00%；血浆和组织样品保存于一30℃低温冰箱7、21d，分别测定浓度以考察稳定性，RSD分别为：血浆1.52%~5.26%，肺组织1.88%~2.93%，脑组织2.22%~3.76%；反复冻融1次和2次测定样品浓度，血浆 RSD 为0.38%~3.55%，肺组织为2.79%~9.60%，脑组织为1.35%~2.29%。结论 成功建立HPLC-MS/MS法测定大鼠血浆及组织中乙奎醚浓度的方法，该法简便、准确、重现性好，可用于盐酸戊乙奎醚药动学和生物利用度研究。 【关键词】 戊乙奎醚 血浆浓度 组织浓度 HPLC-MS/MS 【中图分类号】 R969.1 Detecting Penehyclidine Hydrochloride in Mouse Plasma and Tissues with HPLC-MS/MS YU Qin， LIANG Mao-zhi^， NAN Feng， XIANG Jin， QIN Yong-ping. Laboratory of Clinical Pharmacology， GCP Center， WestChina Hospital， Sichuan University， Chengdu 610041， China A Corresponding author， E-mail： sunny9996@ tom. com 【Abstract】】 Objective To develop a method for detecting penehyclidine hydrochloride (PH) in mouse plasmaand tissues using HPLC-MS/MS. Methods The plasma and tissue samples were extracted with petroleum ether：ethyl ether (70： 30). The isolation of PH was achieved on an Allure C18(50×2.1 mm， 5 um) column， withmethanol/5 mmol/L ammonium acetate/triethylamine=90/10/0.05 (adjusted pH5. 8 by formic acid as mobilephase. Benzhydramine was used as the internal standard. Results The calibration curves were linear over the rangeof 0.39-200 ng/mL for plasma and 0.391-100 ng/mL for tissues. The extraction recovered 67.32%-70.80% of PHin plasma， 84. 99%-89. 27% of PH in lung tissues， and 76.86%-81.98% of PH in brain tissues. The HPLCdetected 97.66%-99.97% of PH in extracted samples of plasma， 96.55%-101.65% extracted samples of lung and95.18%-100.21% of extracted samples of brain. The within-day RSD were 1.94%-2.93%， 1.73%-3.70% and2.35%-2.79% for plasma， lung， and brain， respectively. The between-day RSD were 3.00%-3.85% 2.86%-3. 94% and 2.77%-5.00% for plasma， lung， and brain， respectively. Both the long-term and freeze-thaw stabilitieswere acceptable. The long-term RSD were 1.52%-5.26%，1.88%-2.93%， and 2.22%-3.76% for plasma， lung，and brain， respectively. The freeze-thaw RSD were 0.38%-3.55%， 2.79%-9. 60%， and 1. 35%-2. 29% forplasma， lung， and brain， respectively. Conclusion The assay is simple and accurate， with good reproducibility，and can satisfy to the needs of pharmacokinetics and relative bioavailability studies on penehyclidine hydrochloride. 【Key words】 Penehyclidine hydrochloride Plasma concentration Tissue concentration HPLC-MS/MS 盐酸戊乙奎醚(penehyclidine hydrochloride，PH)为抗胆碱类药物，其对中枢神经有较强的抗毒蕈碱型受体(M受体)、烟碱型受体(N受体)样作 用，对外周神经有较强的抗M样作用和一定程度的抗N样作用。PH对豚鼠离体气管、离体肺的抗乙酰胆碱(Ach)痉挛用用弱于硫酸阿托品，平喘作用与盐酸异丙肾上腺素作用相当；可用于有机磷中毒解毒、平滑肌痉挛性收缩引起的支气管哮喘、慢性支 深圳市高比科技有限公司联系人：水先生电话：13810737909邮箱：water1102@163.com 网址：www.globetechchina.com 气管肺炎等。目前已报道的 PH药动学研究测定方法有 GC-MS/MS、放射受体和放射性同位素方法1.23。本实验建立的高液液相色谱质谱联用法(HPLC-MS/MS)简便、可靠、快速，可用于 PH 大鼠药动学研究。 材料与方法 1.1 实验动物、主要仪器与试剂 动物实验在四川大学华西医院国家药物安全性评价中心完成，采用SD 大鼠进行 PH 给药实验。 采用岛津公司高效液相色谱仪，包括LC-10AD，高压输液泵，SIL-HTc 自动进样器(含系统控制器)，柱温箱；美国ABI公司 API 3000 质谱仪，Analysis1.0 工作站， Mettler AE100 分析天平，Eppendrof 低温离心机。 PH对照品，成都力思特制药股份有限公司提供(含量：99.7%；批号：040901)。内标苯海拉明，购自四川省药品检定所。实验用甲醇为 HPLC级，石油醚、乙醚、醋酸胺等其它化学试剂均为分析纯，石油醚、乙醚经重蒸馏处理后使用。实验用纯水为Millipore 公司 MilliQ仪制备1类水。 1.2 实验条件 1.2.1 色谱条件 色谱柱 Allure C18(50×2.1mm，5pm)，柱温25℃。流动相为甲醇/5 mmol/L醋酸胺/三乙胺=90/10/0.05(V/V/V，甲酸调pH5.8)，流速0.2 mL/min。 1.2.2 质谱条件 离子源为ESI 源，离子源温度375℃，雾化气(NEB)为 12 L/min，气帘气(CUR)为10 L/min，碰撞活化气(CAD)为6 L/min，离子喷雾电压(IS)为5500V。检测方式为多反应离子监测(MRM)，正离子模式扫描。离子去簇电压(DP)PH 94 V，内标 66 V；离子对碰撞活化电压(CE) PH 43V，内标 37 V；环形聚焦电压(FP)PH400V，内标 240V。 1.3 标准溶液配制 精密称取 PH 1.45mg(相当于戊乙奎醚1.3mg)，用50%甲醇水溶液定容于 10 mL 容量瓶，得130 ug/mL PH储备液，保存于4℃冰箱。临用时用50%甲醇水溶液稀释成标准系列工作液。 精密称取苯海拉明对照品2.0 mg，用50%甲醇水溶液溶解并定容于25 mL容量瓶，得80 ug/mL内标贮备液，保存于4℃冰箱。临用时用纯水稀释成2 ng/mL 内标工作液。 1.4 标准曲线制备 取空白血浆、超声匀浆的空白脑组织和空白肺组织0.2mL，分别加人0.1 mL PH标准系列工作液，再加入0.1mL内标工作液，漩涡混匀，加入0.1mL 0.5 mol/L NaOH 液、3 mL 石油醚/乙醚(70/30，V/V)萃取液，漩涡萃取5 min，离心7 min(3000r/min)，转移上层有机相于另一尖底试管；下层液再加人3mL石油醚/乙醚(70/30，V/V)萃取液，漩涡萃取5 min，离心7 min(3000 r/min)，转移上层有机相于前述尖底试管合并，置45℃水浴中通空气流挥干。残留物溶于 0.05 mL 50%甲醇，漩涡溶解1min，分装入全自动进样器，进样0.04 mL。记录PH和内标离子流质谱图的质谱峰面积，以PH 和内标的峰面积比对应其浓度进行线性回归，得PH血浆、脑组织和肺组织标准曲线回归方程。 1.5 样品处理 取给药后 SD 大鼠血浆以及超声匀浆的脑组织、肺组织织0.2 mL，分别加内标工作液0.1 mL，漩涡混匀，再按1.4所述方法操作，记录 PH和内标离子流质谱图的质谱峰面积，计算PH和内标的峰面积比，从相应标准曲线上得到样品中PH浓度。 1.6 预处理回收率和方法回收率 分别配制高、中、低3个浓度(25、6.25、1.5625ng/mL)的 PH血浆和组织样品，按1.4所述方法操作后进样，同时配制绝对进样量相当于各浓度100%含量的对照品工作液直接进样，用预处理后样品的PH峰面积分别与直接进样的峰面积比较，即得预处理回收率。根据标准曲线测得浓度与实际浓度之比即为方法回收率。 1.7 精密度实验 分别配制高、中、中3个浓度(25、6.25、1.5625ng/mL)的PH血浆和组织样品，按1.4所述方法操作，进行鼠血浆和组织的精密度实验。以药物和内标的峰面积比在血浆和组织标准曲线上求出 PH浓度，于同批内连续测定含量7次，计算其批内相对标准偏差(RSD)；于1月内不同日重复测定3批，每批测定7次，计算其批间RSD. 1.8 稳定性实验 分别配制高、中、低3个浓度(25、6.25、1.5625ng/mL)的PH血浆和组织样品，保存于一30℃低温冰箱7、21d后测定浓度，一30℃低温冰箱保存的样品反复冻融1次和2次后测定浓度；计算RSD. 2 结果 深圳市高比科技有限公司联系人：水先生电话：13810737909 邮箱：water1102@163.com 网址：www. globetechchina. com 经Q1扫描后进行二级质谱扫描，得到PH和苯海拉明的二级质谱图，见图1。根据质谱图分析结果，选定进行 MRM 扫描：PH为316.2→128.3〔质荷比(m/z)，内标苯海拉明为256.3→167.1(m/z)。 考察在流速为0.15、0.2、0.3和0.4mL/min时的出峰情况，流速越小，PH和内标的响应越高，最终确定以甲醇/5 mmol/L醋酸胺/三乙胺=90/10/0.05(甲酸调 pH5.8)为流动相，流速为0.2mL/min 条件下测定，测定时间为2.2 min，峰型良好，且无杂质干扰。 在选定的 HPLC-MS/MS条件下，测得大鼠空白血浆、空白脑组织和空白肺组织色谱图，见图2.受试大鼠给药后的选择离子对色谱图见图3。.PH 和内标保留时间分别为1.24和1.18 min，血浆或组织中的内源性杂质对测定无干扰。 2.2 标准曲线及检测限 图 1 盐酸 PH(A)和内标(B)的二级质谱图 Fig 1 MS/MS spectra of PH(A) and diphenhydamine (B) 图2 空白血浆(2A)、空白肺组织(2B)和空白脑组织(2C)测定色谱图 图3 给药后大鼠血浆(3A)、肺组织(3B)和脑组织(3C)定色谱图 Fig 2 Chromatography of blank plasma (2A)， blank lung tissues (2B) and blank brain tissues (2C) Fig 3 Chromatography of plasma (3A)， lung tissues (3B) and brain tissues (3C) 1： PH (1.24 min)； 2： IS (1.18 min) PH血浆标准曲线回归方程：y=0.0485x一0.0251(r=0.9998)；肺组织匀浆标准曲线回归方程：y=0.1500x-0.0084(r=0.9994)；脑组织匀浆标准曲线回归方程：y=0. 3380x-0.0270(r=0.9995)。其中x为测定浓度，y为药物与内标峰面积之比。 血浆标准曲线在0.391~200 ng/mL 范围内线性关系良好，方法最低定量限为0.391 ng/mL；肺和脑组织匀浆在0.391~100 ng/mL 范围内线性关系 良好，方法的最低定量限为0.391 ng/mL。 2.3 提取回收率和方法回收率 PH高、中、低3个浓度水平(25、6.25、1.5625ng/mL)提取回收率分别为：血浆67.32%~70.80%，肺组织84.99%~89.27%，脑组织76.86%~81.98%。方法回收率高、中、低3个浓度水平(25、6.25、1.5625 ng/mL)分别为：血浆97.66%~99.97%，肺组织96.55%~101.65%，脑组织95.18%~100.21%。满足分析方法验证的要 深圳市高比科技有限公司联系人：：水先生电话：：13810737909 求。见表1. 表1 PH提取回收率和方法回收率 Table 1 Extract recovery and methodological recovery of PH Sampel Extract recovery Methodological Concentration (%，n=7) recovery(%，n=7) (ng/mL) 工吐s RSD z士s RSD Plasma 25 69.57±1.82 2.62 98.64±1.99 2.02 6.25 70.80±3.26 4，60 99.97±2.93 2.93 1.5625 67.32±2.01 2.99 97.66±1.90 1.95 Lung tissues 25 86.76±4.43： 5.11 96.86±1.67 1.72 6.25 89.27±0.83 3( 0.93 101.65±2.672.63 1.5625 84.99±0.91 1.70 96.55±3.57 3.70 Brain tissues 25 76.86±2.543.30 99.89±2.79 2.79 6.25 78.34±4.56 5.82 100.21±2.67 2.66 1.5625 81.98±2.773.38 95.18±2.24 2.35 2. 4 精密度实验 PH高、中、低3个浓度水平(25、6.25、1.5625ng/mL)日内精密度 RSD 分别为：血浆1.94%~2.93%，肺组织1.73%~3.70%，脑组织2.35%~2.79%。日间精密度 RSD分另为：血浆3.00%~3.85%，肺组织2.86%~3.94%，脑组织2.77%~5.00%。满足分析方法验证的要求。见表2。 表2PH日内及日间精密度 Table 22 With-in day and between-day precision of PH Smaple With-in day Between-day Concentration (ng/mL) precision(n=7) precision(n=21) Calculated RSD Calculated RSD concentration (ng/mL) (%) concentration (ng/mL) (%) Plasma 25 24.66±0.50 ) 2.02 25.11±0.75 3. 00 6.25 6.25±0.18 2.93 6.31±0.20 3.09 1.5625 1.53±0.03 1.94 1.55±0.06 3.85 Lung 25 24.21±0.421.73 24.82±0.71 2.86 tissues 6.25 5.35±0.17 2.63 6.26±0.21 3.29 1.5625 1.51±0.06 3.70 1.54±0.06 3.94 Brain 25 24.97±0.70 2.79 24.79±0.69 2.77 tissues 6.25 6.26±0.17 2.67 6.26±0.21 3.32 1.5625 1.49±0.03 2.35 1.53±0.08 5.00 2.5 稳定性实验 一30℃保存不同时间的样品浓度 RSD 均<10%，反复冻融1次和2次的样品浓度 RSD 均<5%。满足分析方法验证的要求。见表3、表4. 2.6 方法应用 表3 PH-30℃保存稳定性(n=4) Table 3 Long-term stability of PH(n=4) Sample Concentration 0 day 7 day(ng/mmLl) 21 day RSD (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) (%) Plasma 25 24.55±1.0524.10±1.2524.35±1.12 4，30 6.25 6.16±0.24 6.21±0.25 6.31±0.27 3.74 1.5625 1.52±0.05 1.57±0.11 1.54±0.07 5，26 Lung 25 25.40±0.5725.45±0.6425.70±0.57 1.88 tissues 6.25 6.42±0.11 6.16±0.01 6.53±0.15 2，93 1.5625 1.58±0.07 1.59±0.01 1.60±0.01 2.08 Brain 25 25.55±0.21 24.65±0.7825.00±0.28 2.22 tissues 6，25 6.06±0.23 5.99±0.36 6.15±0.23 3.76 1.5625 1.55±0.01 1.50±0，07 1.52±0.07 3.31 本法用于大鼠按 200 ug/kg气给给药药动学研究实验取得满意结果，药-时曲线见图4。PH经气雾给药的体内过程均符合二室开放模型，体内呈一级动力学过程，血药浓度均表现出较大的个体差异。 表4 PH反复冻融稳定性(n=4) Table 4 Freeze-thaw stability of PH(n==4) Sample Concentration (ng/mL) 0 (ng/mL) 1st (ng/mL) 2nd (ng/mL) RSD (%) Plasma 25 24.66±0.5025.60±0.4923.85±0.64 3.55 6.25 6.25±0.186.33±0.266.00±0.01 2.78 1.5625 1.53±0.031.52±0.011.53±0.08 0.38 Lung 25 24.21±0.4225.40±0.5725.90±0.42 3.45 tissues 6.25 5.35±0.176.42±0.116.26±0.01 9.60 1.5625 1.51±0.061.58±0.071.59±0.01 2.79 Brain 25 24.97±0.7025.55±0.2124.95±0.78 1.35 tissues 6.25 6.26±0.176.06±0.236.22±0.05 1. 71 1.5625 1.49±0.031.55±0.011.49±0.02 2.29 图4大鼠喷雾给予PH(200 pg/kg)后血浆药物浓度-时间曲线图 Fig 4 Concentration-time curve in rats after administered PH (200pg/kg) 3 讨论 PH为某公司研制的 SFDA注册化学药品1类新药(批件件2005L04680)，目前关于分析方法的报道笔者仅仅到一篇采用 GC-MS/MS 法测定家兔血浆PH浓度的方法，内标采用氛标记PH。另一篇文献采用放射受体和放射性同位素方法测定鼠血浆PH药物浓度，测定范围在4~60 ng/mL[23。根据PH的结构特点， GC-MS/MS较 GC-MS法更适合测定 PH的药物浓度。实验中分别采用 ESI的正离子和负离子模式以及 APCI 源对 PH和内标进行分析，结果表明采用 ESI 源正离子模式较负离子模式和 APCI的灵敏度高，且杂质干扰少。 PH属碱性药物，实验中分别进行了碱性和非碱性条件提取，结果表明PH在碱性条件下的提取回收率较中性条件明显提高，而且血样杂质干扰大大降低，通过实验比较确认在 NaOH碱性条件下提取率最佳和杂质干扰最少，经过实验不同浓度 深圳市高比科技有限公司联系人：水先生电话：13810737909邮箱：water1102@163.com 网址： www.globetechchina. com NaOH，最终确定 NaOH 浓度为 0.5 mol/L(0.1mL)。本实验同时考察了使用乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚/乙醚(70/30)等不同萃取剂提取药物和内标以及用乙腈直接沉淀蛋白的提取情况，结果以石油醚/乙醚(70/30)提取两次的回收率高并且稳定，故选择在0.1 mL 0.5 mol/L NaOH 条件下用石油醚/乙醚(70/30)萃取两次，方法学验证结果表明本方法满足关于药物体液样品分析的技术指标相关规定。 大鼠气雾给药药动学研究实验结果表明气雾给药的药-时曲线呈现不规则性，可能与气雾局部给药时，在肺部既存在组织间的分布过程，也存在从肺部吸收入血的吸收过程，影响 PH吸收的因素较多，从而表现出药-时曲线的吸收相血药浓度波动较大的不规则吸收现象。 ~人 (上接第147页) MRS 技术定量分析肝脏脂肪含量的准确性已经超过同去相位双回波技术，因此，对于同为腹腔内实质性器官的胰腺，相信随着 MRS 技术的发展，其作为一种无创、活体、稳定和精确度高的量化胰腺脂肪含量和评价胰腺脂肪浸润的影像学检查技术，可与同去相位双回波技术相配合，甚至超越同去相位双回波技术，成为监测胰腺脂肪浸润情况的主要方法。 ( 参 考 文 献 ) ( Muoio D M， Newgard CB. Obesity-related derangements inmetabolicregulation. Ann u Rev Biochem， 2006 ； 75(1)：367-401. ) ( 2 Matsumoto S， Mori H， M iyake H ， et a l.Uneven f atty replacement o f the pancreas： e valuation with CT. Radiology， 1995；194(2)：453-458. ) ( 3 Heilbronn L， Smith S R， Ravussin E. Failure of fat cellproliferation，mitochondrial function and fat oxidation results in ectopic fat storage， insulin resistanc e and type I diabetesmellitus. Int Obes Relat MetabDisord，2004；28(suppl 4 ) ：12- 21. ) ( 4 Feigelson J， Pecau Y， Poquet M， etal. Imaging changes in the pancreas i n c ystic f ibrosis： a retrospective evaluation o f 5 5 cases seen over aperiod of 9 years. Pediatr Gastroenterol Nutr， 2000；30(2)：145-151. ) ( 5 Tham RT， Heyerman HG， Falke TH， et al. Cystic fibrosis： MR imaging of the pancreas.Radiology，1991；179(1)：183-186. ) ( 6 Campbell-Tofte J， H ansen HS， Mu H， et a l . Inc r eased lip i ds ) 本实验成功建立 HPLC-MS/MS 法测定大鼠血浆、大鼠肺组织和大鼠脑组织的PH药物浓度的方法，采用苯海拉明为内标，较之同位素标记的内标物更容易获得也更价廉，具有可推广性。该方法的大鼠血浆戊乙奎醚浓度测定范围定0.319~200 ng/mL，大鼠肺组织和大鼠脑组织测定范围为0.319~100 ng/mL。 ( 参 考 文 献 ) ( 1 薛 明，阮金秀，袁淑兰等.盐酸 PH外消旋体在家兔体内的药代动力学研究.中国兽药杂志，2002；36(8)：17-19. ) ( 2 乔建忠，袁淑兰，张振清等.盐酸 PH在小鼠体内的药动学研究.中国药学杂志，2003；38(12)：942-944. ) ( (2009-06-18收稿，2009-10-09修回) ) ( 编辑 余 琳 ) ~ ( in nonlipogenictissues a re indicators o f the s e verity o f t y pe 2 diabetes in mice. Prostaglandins Leukot E ssent Fatty A c ids， 2007；76(1)：9-18. ) ( 7 Unger RH， Or c i L. Di s eases of liporegulation： new perspective on obesity and related disorders . Faseb，2001；15(2)：312-321. ) ( 8 Schaffer JE. L ipotoxicity： when t issues overeat. Curr OpinLipido，2003；14(3)：281-287. ) ( 9 Kim HJ， B y un JH， Pa r k SH， et al. Focal fatty r eplacement of the pancreas： usefulness of chemical shift MRI. AJR，2007；188 (2)：429-432. ) ( 10 Schwenzer NF， M achann J， Martirosian P，etal. Quantification of pancreatic lipomatosis and liver steatosis by MRI：comparisonof in/opposed-phase and spectral-spatial e x citation t e chniques.Invest Radiol，2008；43(5)：330-337. ) ( 11 Cassidy FH， Yokoo T， Aganovic L， e t al. Fatty liver disease- MR i m aging techniques for detection and q u antification of liver steatosis . Radiographics，2009；29(1)：231-260. ) ( 12 杨正汉，郑建军，赵伟峰等.平衡稳态自由进动反相位成像序列在上腹部含脂病变中的初步应用.临床放射学杂志，2006； 25(10)：936-940. ) ( 13 Pereira JM， Sirlin CB， Pinto PS， et al . CT and MR imaging of extrahepatic fatty masses Sof th a e bdomen and pelvis： techniques， di agnosis， di f ferential diagnosis， and pitfalls. Radiographics，2005；25(1)：69-85. ) ( 14 晋 云，陈 刚，张绍祥等.胰腺及其周围结构的多方位断层解剖研究.第三军医大学学报，2007；29(23)：2271-2273. ) ( (2009-07-22收稿，2009-10-27修回) ) ( 编辑 余 琳 )