用安捷伦Bio-Monolith Protein A HPLC 色谱柱快速测定人多克隆IgG

前言 ● 用安捷伦Bio-Monolith Protein A HPLC 色谱柱快速测定人多克隆IgG ● 应用报告 生物制药 作者 摘要 Lidija Urbas， Peter Brne， Bostjan Gabor， SaSo Plevcak， and Milos Barut BIA Separations Teslova 30 SI-1000卢布尔雅那 斯洛文尼亚 Taegen Clary 安捷伦科技公司 5301 Stevens Creek Blvd. Protein A 是金黄色葡萄球菌的免疫球蛋白-Fc(lgG)受体，对多克隆和单克隆 IgG有强亲和性。嵌合 Protein A 受体的色谱介质常被用于 IgG的制备和生产规模的纯化。由于具有高选择性和高回收率，可以一步完成从复杂混合物中分离 IgG。基于同样的原因，高选择性和高回收率，FProtein A 色谱也可以开发为分析型。Bio-Monolith Protein A HPLC 柱可以用于复杂混合物或纯样品中 IgG的快速分离和定量分析。在这里，我们将介绍一种简单的方法，用Bio-Monolith Protein A 柱对人血浆中的多克隆 lgG 进行分离和定量。所介绍的方法也可以用于检测 IgG 大规模生产过程中的发酵效价。 美国 实验部分 Bio-Monolith Protein A 柱具有高选择性和高回收率的特点，分离不受流速影响。该色谱柱由一个整体的短棒状圆盘组成，其中有连续通道，无孔隙，无死体积。这种棒状结构消除了扩散，可快速传质，尤其适用于生物大分子。 lgG的快速分离和定量对发酵和规模化制备过程中的许多决策非常重要。能够高效获取生产中 IgG产品符合安全性和纯度的指标，以及IgG纯化过程的参数是至关重要的。用 Bio-Monolith Protein A 柱可以比 PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)或免疫分析法更快得到这些数据。该分析的灵敏度、线性、准确度和速度都非常适于复杂样品(人血浆或细胞培养液)中 IgG的定量测定。 结果和讨论 用Bio-Monolith Protein A 柱分离人血清中的多克隆 IgG。采用了两个流速，说明用 Bio-Monolith 柱分离与流速无关。图1显示流速1 mL/min 和2 mL/min (分别相当于10个柱体积/分钟和20个柱体体/分钟)时 IgG 洗脱图谱不变。几分钟内即可获知样品中是否存在 IgG 及其浓度。 安捷伦Bio-Monolith Protein A柱(左)、Bio-Monolith 柱管和整体圆盘(右) 图1. Bio-Monolith Protein A 柱的 lgG 洗脱图谱不依赖于所采用的流速 灵敏度和回收率对于分析和生产规模的 IgG分离非常重要。Bio-Monolith Protein A 柱的选择性使其能够从复杂混合物中捕获IgG。图2显示了用 Bio-Monolith Protein A 柱从复杂样品、人血浆中分离IgG。用结合缓冲液(PBS缓冲液， pH7.4)将人血浆稀释10倍，取10 uL样品在1mL/min 流速下进样至 Protein A 柱。采用逐级梯度，100%缓冲液A切换到100%缓冲液B， 洗脱出 lgG 单峰。图3显示了图2中分离的全部血浆馏分的 SDS PAGE 分析结果。 IgG 存在于分离前的全血清中(条带1)、纯化的IgG标准(条带2)，以及图2中的洗脱馏分或峰2(条带4)。图2中的流出组分峰1(条带3)不含IgG1或 IgG2， 只有不与蛋白A结合的 IgG3。通过向人血浆中添加已知浓度的 IgG 测定 IgG 的回收率，绘制校正曲线。测 定了血浆样品中的 IgG浓度，并与文献值进行了比较。IgG结合在柱子上，而其它血浆蛋白则被洗出。测得的回收率为95%到100%。 测定细胞培养上清液中的 IgG 浓度非常重要。为了从细胞中得到最大的 IgG产率(高效价)，需要有快速而可靠的分析方法。我们用 Bio-Monolith Protein A 柱建立了一条6点校正曲线，可以用来测定复杂混合物中的 IgG 浓度。图4显示用初浓度为2 mg/mL 的IgG，系列倍比稀释，对 IgG峰面积进行积分，得到的结果。分析方法的线性范围可覆盖 IgG开发和生产细胞培养液所要求的浓度范围。 图2. Bio-Monolith Protein A 柱对人血浆 IgG 的选择性。IgG与蛋白A结合，进入100%缓冲液B逐级梯度时， IgG于1.5分钟被洗脱 图3. 对图2中分离组分的 SDS PAGE 分析 2.5 图4. 人IgG 浓缩液系列倍比稀释的结果 用 Bio-Monolith Protein A 柱可有效地监测 IgG纯化过程，并验证产品纯度。用分析结果确保了纯化生产是在指标范围内进行，与PAGE 或免疫分析相比，能更快得到结果。Bio-Monolith Protein A 在1到2分钟内分离IgG， 并具有高回收率(95%到100%)。灵敏度、线性、准确性和分离速度也完全适合 IgG定量。该方法可用于各种复杂样品的分离和定量分析。 更多信息 如需了解我们产品和服务的更多信息，请访问我们的网站 www.agilent.com/chem/cn。 www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料中出现的错误，以及由于提供或使用本资料所造成的相关损失不承担责任。 本资料中涉及的信息、描述和规格，如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技公司，2007年 2008年10月16日中国印刷 5989-9733CHCN ： Agilent Technologies Agilent Technologies