谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测方案(液相色谱仪)

液相色谱法测定谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)又名呕吐毒素，是一种单端孢霉烯族毒素。主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生。DON污染粮谷的情况非常普遍。世界各地均有报道，特别在中国、日本、美国、阿根廷和南非。在我国胃癌、食管癌等恶性肿瘤高发区．DON是居民饮食中主要的污染霉菌毒素之一。DON主要在田间侵染小麦、玉米等谷类作物，当人摄入了被DON污染的食物后。会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。 DON化学名称为3，7，15一三羟基一12，13一环氧单端孢霉一9一烯一8一酮，为无色针状晶体。熔点为151。153℃。其化学性能非常稳定，具有较强的热抵抗力和耐酸性．在pH值10．O条件下。100℃加热60min部分被破坏，120℃加热30 min和170℃加热15 min完全被破坏【”。目前，测定粮谷作物中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法很多，如薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、酶联免疫法(ELISA)等。本文采用了液相色谱法，使用海能LC7000液相色谱仪配紫外检测器和C18亲水性分离柱，不仅获得了准确的测定结果．而且极大地提高了工作效率。 l 材料与方法 1．1仪器 海能LC7000液相色谱仪(配备紫外检测器)，7mILOGY呕吐毒素专用净化柱TC—T200，C18亲水性分离柱，旋转蒸发仪，高速均质机，真空泵，小型粉碎机。 1．2试剂 乙腈(Merck，色谱纯)，甲醇(Merck，色谱纯)，呕吐毒素标准品(FERMENTEK LTD)。 1．3 操作步骤 (1)提取称取粉碎过筛样品25．O g于均质杯中，加入100 mL y(乙腈)：y(水)=84：16提取液，于高速均质机上均质4 min，静置。 (2)净化浓缩取2 mL样品提取液上清液到净化小柱顶端，向下推活塞，使溶液全部过柱，收集净化后溶液放入100 mL标准磨口蒸发瓶中．取出注射器，加入8 mL y(乙腈)：y(水)=84：16提取液到柱顶端，将溶液彻底过柱，合并净化液，于60℃减压蒸干。用2 mL流动相定容。 1．4测定 色谱条件：C18亲水性分离柱(250×4．6 mill，5斗m)，柱温箱40℃，紫外检测器波长220 nm，流动相：y(水)：y(甲醇)：y(乙腈)=92：4：4，流速1．5 mL／rain，进样量20斗L。标准曲线的绘制：使DON质量浓度分别为0．10、0．25、0．50、1．00、2．00、5．00、10．00ug/mL，将该标准系列分别进样20灿L，以DON的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。 1．5验证 (1)空白样品制备取空白样品，依据样品的处理方法进行处理。 (2)回收率及精密度试验取空白样品。加入不同体积DON标准储备液，使其最终进样液理论质量比分别为100、300、1 000 Ixg／kg。每个质量比取5个平行样，根据样品的处理方法进行处理。 2 结果 2．1定性分析 DON标准样品定性分析色谱图见图1。 由图l可以看出DON保留时间为14．095 min。 2．2定量计算 样品中DON含量为 式中：x——样品中DON的含量，ug/kg；C——由标准曲线查得进样液质量浓度，ug/mL；样品质量，g 2．3标准曲线 由图2可见线性关系为Y=20．78521X(R=0．99987)，根据信噪比3倍峰面积，计算出本方法的 最低检出限为50ug/kg。 2．4 方法验证 2．4．1专属性 从图3可见。在DON的出峰时间14．095 min左右没有杂质干扰峰，表明本方法专属性很好。 2．4．2 回收率及精密度实验 取两组不同含量的样品各6个．分别确定方法的精密度。结果见表1。 取同一样品，分别加入不同质量比的标准样品，测定回收率．结果见表2。 从表2可见．该检测方法回收率为90．7％-98．9％，可以满足分析的需要。 3讨论 3．1提取方法对回收率的影响目前，采用较多的提取液是y(乙腈)：y(水)=84：16，但提取方法却各不相同，本方法则采用高速均质4 rain。用4种常见的提取方法对添加同样质量浓度0．50 la,g／mL的样品进行提取，测定其回收率，测定结果见表3。 由表3可以看出，振荡、超声、磁力搅拌提取方法的平均回收率只有70％左右，不能满足分析的需要，而高速均质法可使平均回收率达到95．9％。作者曾进一步改变高速均质的时间来对比回收率，实验结果表明，随着均质时间的延长回收率有小幅上升，当均质时间大于4 min后。回收率无明显提高。故本方法确定的最佳提取方式是高速均质4 min。 3．2液相色谱法与气相色谱法、酶联免疫法测定谷物中DON的效率及不确定性比较GB/T5009．111-20031第二法中规定采用酶联免疫法(ELISA)，而现在气相色谱检测方法也倍受关注。将这3种方法在检测效率及不确定性方面做了比较2，见表4。 3种方法比较表明：气相色谱法需要的检测时间最长，液相色谱法需要的检测时间最短；从对检测环境的要求来比较。液相色谱法和气相色谱法都对环境温度不做要求。而酶联免疫法的稳定性受环境温度影响较大；从操作时间的要求来比较，液相色谱法和气相色谱法因为在每个操作步骤中没有较多的时间上的要求，所以不会因为处理样品数量多而造成前后样品反应时间不同而形成的误差，而酶联免疫法由于每步受到严格的时间限制，所以每批不可处理太多样品。以免产生误差。从而使检测变得繁琐。 比较3种方法的效率不确定性后可以看出．本方法测定谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇比气相色谱法和酶联免疫法具有优势。 4 结论 通过实验建立了一种测定谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的液相色谱方法．回收率高、精密度和准确性好。较气相色谱法和酶联免疫法具有很高的检测效率，而且对环境的要求比较低，操作简单易行。