牛奶中过氧化氢快速检测试纸条的研制

纳锘仪器nano instrument食品科技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测 牛奶中过氧化氢快速检测试纸条的研制 谢 莉，李春生，张 铎²，刘园园 (1.河北省科学院生物研究所，石家庄050081； 2.河北化工医药职业技术学院，石家庄050026) 摘要：当前，食品安全问题日益突出，其中乳乳品安全问题也备受关注，为了防止牛奶变质，不法经营者向牛奶中掺入过氧化氢，对消费者健康造成巨大威胁。传统的过氧化氢检测方法复杂且耗时较长，为满足现场快速、准确检测过氧化氢残留的需求，本研究利用酶促反应原理，将含有1 g/L的四甲基联苯胺(TMB)和10 pg/mL的辣根过氧化物酶(HRP)混合溶液作为显色剂，并加入适当的保护剂，以定量滤纸为载体，经真空干燥并加工制成过氧化氢快速检测试纸条。该试纸条能够在10秒钟内对牛奶中的过氧化氢残留进行半定量检测，最低检出限达到0.5mg/L，并且操作简单，价格低廉，一十分适用于奶制品厂和基层奶站的现场检测。 关键词：乳品安全；过氧化氢；；试纸；快速检测 中图分类号：TS252.7 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2012)03-0301-04 Preparation of test paper for quick checking of hydrogen peroxide inmilk XIE Li'， LI Chun-sheng'， ZHANG Duo， LIU Yuan-yuan' (1.Hebei Institute of Biology， Shijiazhuang 050081；2.Hebei Chemical Engineering and Pharmaceutical College， Shijiazhuang 050026) Abstract： At present， the problem of milk safety is important in our country in the field of food safety.Hydrogen peroxide(H202)， as effective and inexpensive preservative is widely used in milk.. The traditionaldetecting method of hydrogen peroxide， whose residues presented on food exceed bid will threaten humanhealth， is complex and time-consuming. In order to find out a quick and easy detecting method， a testpaper which was made by adding mixture of 1 g/L TMB， 10 pg/mL HRP and appropriate protectant on filterpaper followed by vacuum dehydration was used to hydrogen peroxide semiquantitative detection.Thedetection limit is 0.5 mg/L and can be completed in 10 second. In conclusion， our simple and inexpensivedetection method can be widely employed in milk intermediate links. Key words： milk safety； hydrogen peroxide； test paper； rapid detection 随着人们生活水平的提高和对牛奶营养价值 认识的提升，奶制品越来越受到消费者的青睐， ( 收稿日期：20 1 1-08-02 ) ( 作者简介：谢莉(1976一)，女，硕士，工程师 ， 主要从事食品安全方面的研究工作。 ) 现已经成为普通人生活中必不可少的营养品。然而，牛奶是一种营养成分非常丰富的物质，微生物极易在其中大量繁殖。为了使牛奶的微生物指标达到收购标准， 一些唯利是图之人就会向牛奶中加入一些防腐剂以抑制细菌的繁殖1-21。过氧化氢(双氧水)作为防腐剂的一种，它无色、无味、并且很容易得到，因此成为最常用的添加物。但过氧化氢的加入不但会直接影响成品奶的质量，而且危害了消费者的健康3。现在国内已经有不少食用含有过氧化氢的牛奶引起食物中毒事件的报道4-51。 我国规定过氧化氢最终在食品中不能被检出。但目前国内并无相关的检测标准，现行主要应用化学分析法和仪器分析法77-91。然而这些传统的检测方法大多操作繁琐，不适用于基层奶站的使用。为了保障食品安全，提高奶制品的质量，研究开发一种快速准确的检测方法对牛奶进行监测具有重要意义。 国外对过氧化氢快速检测试纸条的研究较多且有了相应的商品，国内目前已也有相关方面的初步研究，但主要集中在碘化钾-淀粉法10，其显色结果不易辨别，并且保存期较短。目前还未见到利用酶促显色反应制成过氧化氢检测试纸的报道。本试验正是利用此反应原理研制出了快速检测过氧化氢的试纸条，该试纸条显色迅速，层次清晰，同时具有较好的稳定性，易于保存，因此本产品具有很强的市场竞争力。 1 材料与方法 1.1 试剂 辣根过氧化物酶(HRP)、四甲基联苯胺(TMB)： Sigma公司；过氧化氢、无水乙醇、柠檬酸均为分析纯；；中速定量滤纸(双圈牌).纳诺实业 1.2仪器 DZF-6050型真空干燥仪：上海森信实验仪器有限公司)；PL2002型电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司。 1.3方法 1.3.1 原理里在过氧化氢存在条件下，辣根过氧化物酶(HRP)能催化无色的四甲基联苯胺(TMB)生成淡蓝色物质，其生成物质颜色的深浅与过氧化氢的浓度呈正相关。 ( 其反应式如下： H，0+还原型TMB(无色) HR P →被氧化的TMB(蓝色) ) 1.3.2 显色液的配制 准确称取20mg TMB，用2mL无水乙醇溶解后，再用柠檬酸缓冲液定容到100mL，最后加入1 mg/mL的HRP1mL，混合均匀。 1.3.3过氧化氢检测试纸条的制备将裁剪好的滤纸条(0.5 cm×10 cm)放入盛有显色剂溶液的容器中，浸泡5 min后用镊子取出，抽真空干燥制得过氧化氢检测试纸。为方便使用，将处理好的显色试纸切割成规格为0.5 mmx0.5mm的试纸片，作为反应区黏接在准备好的长形硬白纸条上，即制成过氧化氢检测试纸条。 1.3.4过氧化氢的检测则取一系列的比色管，各加入牛奶10mL，向其中一部分牛奶中按比例加入过氧化氢溶液，然后将试纸条反应区直接插入牛奶中或者用玻璃棒蘸取牛奶直接点加到试纸条顶端的反应区上，取出放置片刻，观察试纸条的显色情况。随着牛奶中过氧化氢浓度的增大试纸颜色会呈现由浅蓝色到深蓝色的梯度变化。 1.3.5 显色液中TMB含量的优化 调整TMB的使用量，使TMB在显色液中浓度分别为0.2、0.5、0.8、1、1.5、2g/L。用1.3.3中方法依次备备出过氧化氢试纸，进行过氧化氢的测定，观察试纸的显色情况。选择滴加含有不同浓度过氧化氢牛奶后显色迅速并且颜色梯度明显的的TMB浓度为最佳使用浓度。 1.3.6 显色液中HRP含量的优化 在确定好TMB使用浓度之后，再调整显色液中HRP的量，制备成一系列试纸并进行测定，观察试纸的显色情况，选择滴加含有不同浓度过氧化氢牛奶后显色迅速并且颜色梯度明显的的HRP浓度为最佳使用浓度。 1.3.7试纸条的灵敏度测试选用试验得到的最佳配方配制显色液，制备成过氧化氢试纸条。观察与牛奶中不同浓度的过氧化氢溶液显色情况。取用肉眼刚能辨别试纸显示的浅蓝色，此时过氧化氢的浓度即为试纸的最低检测浓度，即检测试纸条的灵敏度。 1.3.8 标准比色卡的制作向牛奶中加入一定量的过氧化氢溶液，使其浓度达到0、0.5、2、5、10、30 mg/L，取新鲜制备的试纸条浸入上述溶液中迅速取出，片刻试纸呈现深浅不同的颜色，然后用数码相机拍摄显色后的试纸，冲洗相片剪裁后制得过氧化氢试纸标准比色卡。在比色卡的每一色阶标明过氧化氢的浓度值，单位为mg/L。 1.3.9试纸条的保存将制作好的试纸条分装在密 封性良好的圆形塑料瓶中，每瓶100条，加入干燥剂后拧好瓶盖密封。每次使用时取出所需试纸条后，迅速拧好瓶盖。置于4℃冰箱保存。 1.3.10 试纸条的稳定性测试从密封瓶中取出试纸条，置于桌面上，随时观察颜色变化，每隔10min进行灵敏度测试。 1.3.11 试纸条的保存期测试取新鲜制备的过氧化氢试纸条，分别放在室温阴凉处和4℃冰箱保存，每间隔1个月取出适量的试纸条，用含有相同浓度的过氧化氢牛奶样品测定试纸的显色效果，以此确定过氧化氢试纸条的保存期。 2结果与分析 2.1 试纸条的制备与检测 采用浸泡的方法，将显色剂TMB和HRP等成分固定在滤纸上，为防止制备过程中空气中的氧分子干扰而使显色液变色，失去使用效果，浸泡滤纸一定要在密闭的容器中进行，同理，也要采用抽真空的方法进行干燥，这样制作出的试纸呈现出均匀的白色。制成的试纸条在滴加含有过氧化氢的牛奶后，反应区出现颜色变化，并且随着牛奶中过氧化氢浓度的增加，显色速度加快，颜色加深。 2.2 TMB的最佳使用浓度 研究发现，试纸的显色速度与显色液中TMB的浓度密切相关。TMB浓度越高，显色会越快，但是含有高浓度TMB的试纸在制备过程中很容易被氧化变色失去使用效果，同时也不利于试纸的保存；显色液中TMB浓度过低，检测时会使试纸显色时间延长，且整体显色颜色偏浅，颜色对比度差，不利于肉眼比色测定。综合考虑， TMB在显色液中的浓度为1 g/L时，制成的试纸为均匀的白色，在滴加不同浓度过氧化氢奶液后试纸迅速显色，因此确定TMB的最佳使用浓度为1 g/L。 2.3HRP的最佳使用浓度 在确定好显色液中TMB的浓度后，对催化TMB显色的HRP使用浓度进行试验，研究发现在较低酶浓度条件下，随着HRP量的加大，显色时间会缩短，且显色后颜色梯度更加明显，但是当HRP浓度大于10 ug/mL后，任凭加大使用量，试纸的显色速度和显色梯度都不会有变化，即HRP的量达到了饱和。因此确定HRP的最佳使用浓度为10 ug/mL。在此条件下制备的试纸滴 加掺有过氧化氢的牛奶后10s内就会出现颜色变化，并且梯度明显，试纸鲜艳程度可以稳定30min不改变。 2.4 试纸条的灵敏度 以最佳显色液的配方制备试纸条，测试试纸的最低检测限。研究发现检测含有0.1、0.2、0.5mg/L3种浓度过氧化氢的牛奶时试纸颜色变化不明显，在纯牛奶对照的情况下，肉眼才能勉强分辨出检测浓度为0.2 mg/L过氧化氢时试纸的颜色变化，最后确定试纸的灵敏度为0.5 mg/L。即当牛奶中过氧化氢浓度大于或等于该值时，试纸显色结果很容易被肉眼辨别。 2.55标准色卡的制作 由于TMB被氧化生成有色物质的量是与过氧化氢的浓度成比例的，所以根据不同过氧化氢浓度下试纸显色程度不同，制作标准比色板，检测样品时只需将试纸所显示颜色与标准色卡进行比对，就可以对牛奶中过氧化氢含量进行半定量的判断。 2.6试纸条的稳定性 将试纸条置于空气中，观察发现在30 min内，试纸颜色为白色，同时检测灵敏度也没有任何变化。但当试纸条取出放置时间超过30 min后，由于空气中氧气的作用，试纸本身颜色逐渐由最初的白色变成浅蓝色。在此过程中，通过与显色卡比对，发现试纸本身颜色与过氧化氢浓度为0.5 mg/L时的色度相近，继续进行观察发现，已变成浅蓝色的试纸即使连续放置24 h，本身颜色也不再发生变化。使用这种试纸条检测浓度高于0.5 mg/L的过氧化氢时，试纸颜色仍然能够继续加深，显示出梯度变化。因此，试纸条需要密封保存，每次使用时取出需要的试纸条后，立即封好瓶口。 2.7证试纸条的有效期 因为固定在试纸上参与显色反应的HRP为-种生物酶制剂，它随放置时间的延长活性会逐渐下降，致使试纸显色灵敏度降低，直至不再显色。为此本研究向显色液中加入了适当的显色剂保护剂和酶保护剂，可有效延长试纸的使用寿命。研究表明，在室温条件下和4℃冰箱内保存一年，检测发现从试纸颜色、显色时间、灵敏度上观察都与制作时一致，说明本研究制作的试纸条对保存条件要求不高，有效期至少为1年。 3结论 本研究利用酶促显色反应原理，研制出了检测牛奶中过氧化氢的快速测试条，该试纸条可在10s内对牛奶中过氧化氢进行半定量检测，最低检测极限为0.5 mg/L， 并且显色层次清晰，试纸条保质期至少为一年。该试纸条具有携带方便，操作简单快捷，现象明显，价格低廉等特点，可用于奶厂收奶以及基层奶站，对控制牛奶质量具有重要意义。 ( 参考文献： ) ( [1] 陈群来.我国过氧化氢的生产和应用.现代化工，2001， 21(1)：11-14 ) ( [2] 荆文清，罗晓红，张丹凤.牛奶掺假及其鉴别[J].中国乳 业，2002，(2)：22-23 ) ( [3] 周健洪，黎晖，宋述财，等.过氧化氢对骨髓间充质干细胞 ) (上接第300页) ( [3] 回瑞华，侯冬严，郭华，等.薏米营养成分的分析[J].河北化 工，2007，30(3)：52-54 ) ( [4] 耿亚鹏，张慧敏，李小川.固相微萃取技术及其在分析中的应用[J].食品与生物技术学报，2010，29(4)：500一507 ) ( [5] 温莹莹，马荣山.薏米酒自选酵母的性能测试及其酿造工 艺的研究[J].酿酒，2006，33(6)：82-84 ) ( [6] 李华.现代葡萄酒工艺学[M].西安：陕西人民出版 社，2000：123-150 ) ( [7] 盖禹含，辛秀兰，杨国伟，等.不同酵母发酵的蓝莓香成分 GC-MS分析[J].食品科学，2010，(31)：4，171-174 ) ( [8] 王贞强，马波，迟建，等.荔枝酒香气成分的GC/MS分析[J]. 食品科学.2006.22(8)，135-138 ) ( [9] 刘晓艳，白卫东，黄玩娜.柿子果酒香气成分的GC-MS分 析[].酿酒，2011，38(1)：52-56 ) ( 增殖活性舌影响.广东医学，2005，26(9)：1199-1200 ) ( 江国虹，杨溢，白世基，等.一起过氧化氢污染学生奶事件的调查报告.中华预防医学杂志，2003，37(5)：391 ) ( [51 王文涛，刘忠贤.一起由过氧化氢残留消毒鲜牛奶中引发的食物中毒.肉品卫肉，2001，205(7)：11 ) ( [6] 食品添加剂使用卫生标准[S].中国标准出版社，GB2760 -1996 ) ( [7 ] 王瑞斌.过氧化氢含量准确测定方法的研究.化学工程 师，2005，12(12)：62-64 ) ( [81 Wu ZS， Zhang SB， Guo MM， et al. 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