谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测方案(液相色谱仪)

纳诺仪器nano instrument粮食加工2010年第35卷第6期 粮食加工2010年第35卷第6期93 液相色谱法测定谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇 刘 旭，李 尧，龚 珊，任正东，赵 鹏，陈晓峰 (陕西省粮油产品质量监督检验所，西安710016) 摘 要：建立检测谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的液相色谱方法，通过不同提取方法的比对来确定最佳的 DON 提取方案，并最终确定使用乙腈-水(体积比 V/V，84/16)提取，经过 DON 专用净化柱的净化处理后，采用紫外检测器(入=220 nm)及 C18 亲水分离柱测定。结果表明，用高速均质机均质4 min 提取，可大幅度提高方法回收率，回收率达到90.7%~98.9%，方法最低检出限为50 ug/kg。 关键词：脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)；液相色谱法；谷物 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)又名呕吐毒素，是一种单端孢霉烯族毒素，主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生。DON污染粮谷的情况非常普遍，世界各地均有报道，特别在中国、日本、美国、阿根廷和南非。在我国胃癌、食管癌等恶性肿瘤高发区，DON 是居民饮食中主要的污染霉菌毒素之一。DON主要在田间侵染小麦、玉米等谷类作物，当人摄入了被 DON 污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。 DON 化学名称为 3，7，15-三羟基-12，l3-环氧单端孢霉-9-烯-8-酮，为无色针状晶体，熔点为151~153℃，其化学性能非常稳定，具有较强的热抵抗力和耐酸性，在 pH值10.0条件下，100℃加热60min 部分被破坏，120℃加热 30 min 和170℃加热15 min 完全被破坏目。目前，测定粮谷作物中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法很多，如薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、酶联免疫法(ELISA)等。本文采用了液相色谱法，使用 Agilent 1100 液相色谱仪配紫外检测器和 C18亲水性分离柱，不仅获得了准确的测定结果，而且极大地提高了工作效率。 1 材料与方法 1.11仪器 Agilent 1100 液相色谱仪(配备紫外检测器)，TRILOGY 呕吐毒素专用净化柱 TC-T200，C18亲水性分离柱，旋转蒸发仪，高速均质机，真空泵，小型粉碎机。 1.2 试剂 ( 收稿日期：2010-07-13 ) ( 作者简介：刘旭(1980-)，男，助理工程师，从事粮油卫生检验。 ) 乙腈(Merck，色谱纯)，甲醇(Merck，色谱纯)，呕吐毒素标准品(FERMENTEK LTD)。 1.3 操作步骤 (1)提取称取粉碎过筛样品25.0g于均质杯中，加入100 mLV(乙乙)：V(水)=84：16提取液，于高速均均机上均质4 min，静置。 (2)净化浓缩 取2mL样品提取液上清液到净化小柱顶端，向下推活塞，使溶液全部过柱，收集净化后溶液放放100 mL标准磨口蒸发瓶中，取出注射器，加入8 mLV(乙腈)：V(水)=84：16提取液到柱顶端，将溶液彻底过柱，合并净化液，于60℃减压蒸干，用2 mL流动相定容。 1.4 测定 色谱条件：C18亲水性分离柱(250×4.6 mm，5um)，柱温箱40℃，紫外检测器波长220 nm，流动相：V(水)：V(甲醇)：V(乙腈)=92：4：4，流速 1.5 mL/min，进样量 20 uL。 标准曲线的绘制：使 DON质量浓度分别为0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 ug/mL，将该标准系列分别进样20 pL，以 DON的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。 1.5 验证 (1)空白样品制备取空白样品，依据样品的处理方法进行处理。 (2)回收率及精密度试验取空白样品，加入不同体积 DON 标准储备液，使其最终进样液理论质量比分别为100、300、1000 pg/kg。每个质量比取5个平行样，根据样品的处理方法进行处理。 2 结果 DON 标准样品定性分析色谱图见图1. 时间/min 图1 DON标准样品色谱图 由图1可以看出 DON 保留时间为 14.095 min。 2.2定量计算 样品中 DON 含量为 式中：X—样品中 DON 的含量，ug/kg；C———由标准曲线查得进样液质量浓度， ug/mL；m——样品质量，g. 2.3 标准曲线 由图2可见线性关系为 Y=20.78521X (R=0.99987)，根据信噪比3倍峰面积，计算出本方法的最低检出限为 50 ug/kg。 2.4 方法验证 DON质量浓度/(pgm) 图2 DON标准曲线 从图3可见， 在 DON 的出峰时间 14.095 min左右没有杂质干扰峰，表明本方法专属性很好。 图3 样品色谱图 2.4.2 回收率及精密度实验 取两组不同含量的样品各6个，分别确定方法的精密度，结果见表1。 表1 精密度实验(n=6) 组别 测定结果/(rgmL-) 一 X n=6 RSD/% n=1 n=2 n=3 n=4 n=5 1 0.252 0.254 0.258 0.255 0.263 0.260 0.257 0.0041 1.600 2 1.052 1.061 1.050 1.044 1.060 1.047 1.052 0.0689 0.655 取同一样品，分别加人不同质量比的标准样品，测定回收率，结果见表2。 从表2可见，该检测方法回收率为90.7%~98.9%，可以满足分析的需要。 表2 加标回收率实验 水平 原始质量比 添加量 检出量 回收率 /(gkg) /(ugkg) /(rg*kg) /% 0 100.0 90.7 90.7 2 0 300.0 294.6 98.2 3 C 1000.0 988.6 98.9 3讨论 3.1 提取方法对回收率的影响 目前，采用较多的提取液是V(乙腈)：V(水)=84：16，但提取方法却各不相同，本方法则采用高速均质4 min。用4种常见的提取方法对添加同样质 量浓度0.50 pg/mL 的样品进行提取，测定其回收率，测定结果见表3。 表3 不同提取方法的回收率 提取方法 测定次数/次 平均回收率/% 振荡 30 min 5 72.2 超声5 min 5 71.2 高速磁力搅拌5 min 5 70.5 高速均质4 min 5 95.9 由表3可以看出，振荡、超声、磁力搅拌提取方法的平均回收率只有70%左右，不能满足分析的需要，而高速均质法可使平均回收率达到95.9%。作者曾进一步改变高速均质的时间来对比回收率，实验结果表明，随着均质时间的延长回收率有小幅上升，当均质时间大于 4 min 后，回收率无明显提高，故本方法确定的最佳提取方式是高速均质4 min。 3.2液相色谱法与气相色谱法、酶联免疫法测定谷 物中 DON的效率及不确定性比较 GB/T 5009.111-2003第二法中规定采用酶联免疫法(ELISA)，而现在气相色谱检测方法也倍受 表4 液相色谱法、气相色谱法、酶联免疫法测定谷物中 DON的效率及不确定性比较 关注，将这3种方法在检测效率及不确定性方面做了比较，见表4。 3种方法比较表明：气相色谱法需要的检测时间最长，液相色谱法需要的检测时间最短；从对检测环境的要求来比较，液相色谱法和气相色谱法都对环境温度不做要求，而酶联免疫法的稳定性受环境温度影响较大；从操作时间的要求来比较，液相色谱法和气相色谱法因为在每个操作步骤中没有较多的时间上的要求，所以不会因为处理样品数量多而造成前后样品反应时间不同而形成的误差，而酶联免疫法由于每步受到严格的时间限制，所以每批不可处理太多样品，以免产生误差，从而使检测变得繁琐。 比较3种方法的效率不确定性后可以看出，本方法测定谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇比气相色谱法 和酶联免疫法具有优势。 4 结论 通过实验建立了一种测定谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的液相色谱方法，回收率高、精密度和准确性好，较气相色谱法和酶联免疫法具有很高的检测效率，而且对环境的要求比较低，操作简单易行。 ( 参考文献： ) ( [1]GB/T 5009.111-2003，谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯 醇的测定[S]. ) ( [2]马易怡，郭红卫.气相色谱法检测谷物及豆类中脱氧雪腐镰 刀菌烯醇[.中国卫生检验杂志，2007，17(5)：789-790. ) Determination of Deoxynivalenol in Grains by HPLC LIU Xu， LI Yao， GONG Shan，REN Zheng-dong，ZHAO Peng， CHEN Xiao-feng (Shaanxi Province Grain & Oil Products Quality Supervise Test Institute， Xi'an 710016) Abstract： A HPLC method was developed for deoxynivalenol (DON) in grains. Extraction was carried out withaceronitrile-water mixture (84/16，V/V)， followed by a clean-up step with TRILOGY columns. The extracts wasanalyzed by UV detector (A=220 nm) and C18 column. The results showed that using high-speed Homogenizerextracts 4 min， greatly increased the recovery rate(90.3%~102.1%)，the lowest detection limits was 50 ug/kg. Key words： deoxynivalenol； HPLC； grains (上接第83页)不容易看清楚。应用图解法确定粮食的安全水分，小麦、稻谷和玉米与查表法相比安全水分值比较接近，但大豆安全水分值与查表法相比误差比较大。 ( 参考文献： ) ( [1]LS/T1211-2008，粮油储藏技术规范[S].北京：中国示准出 版社，2008. ) ( [2] LS/T1202-2002，储粮机械通风技术规程[S].北京：中国标 ) ( 准出版社，2008. ) ( [3]路茜玉.粮油储藏学[M].北京：中国财政经济出版社，1999. ) ( [4]王立，魏清国.储粮机械通风技术[M].南京：江苏科学技术 出版社，1989. ) ( [5]严以谨，王金水，苏云平，等.机械通风储粮技术[M].郑州：河南科学技术出版社，1996. ) ( [6]余昆，马述蓉，郭长征.粮食平衡水分计算法在储粮机械 通风技术中的应用[.粮食加工，2007，(6)：73-74. ) ( [7]唐柏飞，郭道林，兰盛斌.粮油储藏重要标准理解与实施[M].成都：四川科学技术出版社，2008. ) 液相色谱法测定谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇 作者：刘旭，，李尧， 龚珊，任正东，，赵鹏，Zheng-dong， ZHAO Peng，CHEN Xiao-feng作者单位：陕西省粮油产品质量监督检验所，西安，710016刊名：粮食加工英文刊名：GRAIN PROCESSING年，卷(期)：2010，35(6) 陈晓峰， LIU Xu1，， LI Yao， GONG Shan， REN 参考文献(2条) 1.GB/T 5009.111-2003.谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 2.马易怡；郭红卫气相色谱法检测谷物及豆类中脱氧雪腐镰刀菌烯醇2007(05) 本文读者也读过(7条) 1..莫晓嵩.黄伟.Mo Xiaosong. Huang Wei高效液相色谱法测定小麦中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇[期刊论文]-现代面粉工业2011，25(1) 2.亓增军.裴自友.韩航如.陈佩度.刘大钧.QI Zeng-Jun.PEI Zi-you. HAN Hang-ru.CHEN Pei-du.LIU Da-jun 利用DONtest-HPLC检测小麦镰刀菌毒素DON含量的差异[期刊论文]-南京农业大学学报2005，28(3) 3.隋凯.李军.卫锋.赵守成.Sui Kai.Li Jun.Wei Feng. Zhao Shoucheng谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的高效液相色谱检测及质谱确谱[期刊论文]-分析化学2005，33(11) 4.降隋凯.李军.卫锋.SUI Kai.LI JJun. WEI Feng多功能柱净化-高效液相色谱法同时检测小麦中雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇[期刊论文]-分析测试学报2006，25(3) 5..表裴自友.韩航如.李亚浩.亓增军.庄丽芳.王秀娥.陈佩度.刘大钧.PEI Zi-you.HAN Hang-ru. LI Ya-hao.QI Zeng-jun. ZHUANG Li-fang. WANG Xiu-e.CHEN Pei-du.LIU Da-jun 两种检测小麦DON含量方法的比较与应用[期刊论文]-麦类作物学报2006，26(5) 6.倪梅林.殷居易.曹苏仙.李佐卿2种检测粮食中呕吐毒素的免疫技术比较[期刊论文]-安徽农业科学2006，34(14) 7.引张爱华.张洪英.何成华.张海彬.ZHANG Ai-hua. ZHANG Hong-ying.HE Cheng-hua.ZHANG Hai-bin -株降解DON毒素真菌的鉴定及其生理特性研究[期刊论文]-微生物学杂志2008，28(5) 引证文献(1条) 1.王娅琴.赵谋明.赵海锋固相萃取-气相色谱-质谱联用法测定酱油中脱氧雪腐镰刀菌烯醇[期刊论文]-食品与发酵工业2012(6) 上海总部 ( 地址 ： 上 海 市 闵 行 区 金 都 路11 6 5 弄 1 23 号2 1 幢 50 0 1 室 浙 江 办事 处 ： 杭州 市 拱 墅区 祥 园 路 3 9 号 1 号 楼3 0 7 室 ) 电话：021-609008296090083061131051 电话：0571-81954578 传真：0571-81954579 邮箱： info@nano-instru.com 江苏办事处：苏州市金门路158号协和大厦2107室 上海纳诺实业有限公司ShanghaiNano Industrial Co..Ltd. 传真：021-61131052 电话：0512-87772272 传真：0512-87772270 邮编：201108 免费服务热线：4009-217-117爱仪器要仅器 网址：http；/www.nano-instru.com http：//nanoinstru.instrument.com.cn 数据