环介导等温扩增技术及其在病原微生物检测中的应用

2013年1月第33卷 第1期基础医学与临床Basic & Clinical MedicineJanuary 2013Vol.33 No.1 202013.33(1)基础医学与临床 Basic & Clinical Medicine C1eauised ylherpes Simpledhruai4 JpjirneiinEMicrobiolCIRublishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net 专题综述 环介导等温扩增技术及其在病原微生物检测中的应用 肖维威，周琳华，郑文岭，马文丽 (南方医科大学基因工程研究所，广东广州510515) 摘要：环介导等温扩增( LAMP) 技术是近年发展起来的一项新的快速核酸恒温扩增技术，具有高效、快速、特异、易检测、易操作等特点，自面世以来被科学家认为是能替代常规 PCR的一页扩增技术，非常适用于现场检测和基层检测。本文就 LAMP技术的原理、特点、进展及其在病原微生物检测中的应用进行了简要的概述。 关键词：环介导等温扩增；检测；病原体 中图分类号： R 444.6 文献标志码： A Loop-mediated isothermal amplification technology and its applicationin pathogenic microorganism detection XIAO Wei-wei， ZHOU Lin-hua， ZHENG Wen-ling， MA Wen-li" (Institute of Gene Engineering， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China) Abstract： Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology is a novel nucleic acid isothermal amplifica-tion technology developed in recent years. Because of its high effiency， rapidity， specificity， and simplicity， scien-tists believe it will be a routine amplification technology replacing the conventional PCR method. This paper brieflyreviews the principle of the technology， techinical characteristics， progress， and its application in pathogenic micro-organism detection. Key words： loop-mediated isothermal amplification； detection； pathogenic microorganism 随着生物医药科学的迅猛发展，检测技术越来越受到重视。核酸扩增是生命科学中最重要的检测手段之一，目前已广泛应用于临床医学诊断和传染病病原体检测等领域。核酸扩增技术主要分为以常规PCR 为基础的变扩扩增技术以及恒温扩增技术两大类。常规 PCR 包括单一PCR、多重PCR、巢式PCR和实时荧光定量 PCR 等，恒温扩增技术包括核酸序列依赖扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NABSA)、滚环DNA 扩增( rolling circle DNA amplifi- cation，RCA)、指数式扩增反应( exponential amplifica-tion reaction，EXPAR)、连接酶链扩增反应( ligasechain reaction， LCR)、链置换扩增反应( strand dis-placement amplification，SDA) 和环介导等温扩增(loopmediated isothermal amplification，LAMP)技术等。因PCR 的变温过程使其对仪器精密度要求较高，操作时间相对较长，从而导致 PCR 无法推广至基层。因此：恒温扩增成为核酸扩增技术的一个研究热点，环介导等温扩增技术就是其中一种。 ( 收稿日期：2012-11-02 修回日期：2012-11-19 ) ( !-2013 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net 通信作者( corresponding author)： we n li668@ gmail.com； 13609018218@ qq. com ) 环介导等温扩增技术又称为环介导恒温扩增技术，是由 Notomi 等于2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法。凭借其高效、快速、特异、低廉、易检测、易操作等特点，从问世以来，短短十几年，即在各种病原体、病毒快速检测、动植物检疫等方面崭露头角，尤其在传染性疾病诊断中发挥了极大作用。随着该技术体系的完善与发展，其在分子检测领域的应用也必将越来越广泛与深入。 LAMP技术的原理 1.1 LAMP 的技术原理 LAMP 技术针对靶序列的6个特异性区域设计2 对引物，利用一种具有链置换活性的 DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase) 在等温条件(65℃左右)保温30~60 min，即可扩增出10°拷贝靶序列，并且伴有肉眼可见的副产物白色焦磷酸镁沉淀产生。 1.2 引物组成 LAMP 的2对引物分别称为 FIP、BIP、F3 和 B3，可识别靶基因的6个不同区域。F3：上游外部引物，由F3 区组成，并与靶基因的 F3c区域互补。B3：下游外部引物，由B3区域组成，和靶基因的 B3c 区域互补。 FIP： 上游内部引物，由F2 区和F1c 区域组成，F2区与靶基因3端的F2c 区域互补，F1c 区与靶基因5'端的 Flc 区域序列相同，两者之间以 TTTT连接。BIP： 下游内部引物，由 Blc 和 B2区域组成，B2区与靶基因3端的B2c 区域互补，B1c 区域与靶基因5端的 Blc 区域序列相同，两者之间以 TTTT 连接(图1)。 1.3 引物设计原则 由于 LAMP 是通过2对引物与6个不同区域的相互识别来产生扩增效应，因此引物设计要求比较 高。LAMP 引物设计一般选取一段长约130~200 bp(最长300 bp，不可超过500 bp) 的保守序列作为靶序列。引物设计需要遵循以下原则：1)要保持引物的退火温度约55~66℃，其中 F1c 和 Blc 的 Tm值最高(64~66℃)，F2 和 B2 次之(59~61℃)，F3 和B3最低(55~60℃)； GC 含量高者，取Tm 范围较高值；而AT含量高者，取Tm 范围较低值。2) B1c、F2 和F3与靶保守序列(5一3方向)的相应部分相同，F1c、B2和B3与靶保守序列的相应部分反向互补。3) F2 的前端与B2之间相距120~180 bp，F2 的前端与 F3 及 B2的前端与B3之间相距0~20 bp，F2 的前端与Flc 及B2 的前端与 B1c 之间相距40~60 bp.4)避免引物二级结构形成，特别是3端不应存在富 AT 区，不能与其他引物互补。5) GC 含量在40%~65%之间，以50%~60%为最佳。 具体设计时，采用在线 LAMP 引物设计软件Primer Explorer 3.0(或 4.0) http：//primerexplor-er. jp/e，并结合 DNAstar 的 MegAlign 模块和 Primer5.0对引物进行综合比较，防止产生引物二聚体。还可以利用在线 BLAST，将设计好的引物在 Gen-Bank 中进行比对确认，以保证引物的特异性。 2 LAMP技术的特点 LAMP 之所以被很多科学家认为可以替代 PCR技术在于其有几大突出特点： 2.1 高效性 LAMP 反应不需要双链 DNA的预热变性，避免了温度循环造成的时间损失。核酸扩增一般在1h内均可完成。在稳定的体系中添加环引物后，时间更可以缩短到原来的1/2，多数情况在20~30 min BIP primer 图1 LAMP 引物设计示意图 ◎ 1994-2013 China Academic FigrhalTheeschematie tdiagramof LAlMP prinersts reserved. http：//www.cnki.net 即有扩增产物可被检测。这对于快速诊断十分重要，便于患者即时获得临床检验结果，医生及时决定治疗方案。 2.2 高灵敏性 与定性PCR 相比，LAMP法的检测率要比其高出1~2个数量级，具有 real-time TaqMan PCR 同样的敏感性，能满足低拷贝数样品的检测，扩增产物靶序列可达到10°以上。有研究发现，加环引物的敏感性要比没有加环引物的高出7个数量级，在极低模板量(0.01 PFU) 即可获得结果。 2.3 高特异性 由于是针对靶序列6个区域设计4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高。 2.4 操作简单 扩增结果判定不需要对产物进行电泳，而可直接用肉眼观察扩增管浊度，或通过向其扩增产物中添加荧光染料再通过颜色变化来判定结果，使结果可视化，操作更简单。 2.5 成本低廉 LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需要恒温水浴锅即可，不需要特殊的试剂及仪器，适合大规模筛检和基层疾病检测。 3 LAMP法的进展 鉴于 LAMP 技术相比于其他核酸扩增方法具有以上多种优点，人们在许多方面对其更进行了改进和研究，使其更加简便快速，以便更适于临床检测的要求。 LAMP 法的进展主要包括： 3.1 检测模板的拓展 除对 DNA 检测外，LAMP 也可对 RNA分子进行检测。 RT-LAMP 的扩增原理与 LAMP相同，只是在反应体系中增加了反转录试剂，使RNA 的反转录和LAMP扩增在同一试管中完成，而不需要分步进行3-5。2008年，Kelly 等研究发现，LAMP法对模板要求不高，可直接用于某些病原微生物样本的检测，而无需对样本中的核酸进行提取纯化，这使LAMP 技术在临床应用中更加简便。 3.2 反应速度改进 D1LAMP是恒温扩增，没有温度变化1994-2的时间损 耗，11 . nina ieimIcJourt ron一般60~90 min即可完成扩增反应，能基本满足临 床病原微生物快速检测的要求，但相比临床常用的ELISA 等免疫学技术，所需时间还是较长，因此人们进行了加快反应速度的研究。2005年， Yoshida等通过在反应体系中添加2条环引物的方法使反应速度大大提高，反应时间缩短一半，在30 min内即可完成反应。 3.3 产物鉴定方法 对于LAMP扩增产物的检测通常有3种方法：1)经琼脂糖电泳，EB 染色观察梯度条带。LAMP 反应中的产物是一系列具有不同茎长度的茎环结构DNA 和带有许多环的类似花椰菜结构的 DNA 混合物，因此当用凝胶电泳分析时，会产生特异的梯状条带。2)肉眼观察。在产物中加入 SYBR Green Ⅰ，变成绿色说明有扩增产物，没有变色说明无扩增产物。3)间接通过对 LAMP 扩增副产物焦磷酸镁白色沉淀形成的浑浊程度进行判断。目前，这种方法已被改进并成功开发出一种实时浊度检测仪图，它也可以用于对靶序列进行定量分析。 3.4 与其他技术联合应用 LAMP 技术在建立之后，人们利用其敏感、简便、快速的特点，将其与其他的技术进行联合，开发了很多有效的检测方法。2004年，Hataoka 等将LAMP法与电泳结合，制成聚丙烯酰胺凝胶基因芯片，用来检测和分析特异性基因类型。2003年，Maruyama 等把 LAMP和原位杂交相结合，建立原位 LAMP(in-situ LAMP) ，用于检测组织细胞中大肠杆菌0157：H，。2006年申建维等在检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌时，将核酸杂交和LAMP技术进行结合，用多重 LAMP 同时扩增金黄色葡萄球菌耐药基因 mecA 和femA。结果该方法的最低检测限为10 CFU/mL，与药敏试验结果相比较，灵敏度为99.0%，特异性为90.9%，证明该方法灵敏度高，特异性强，操作简便快速，适用于临床病原微生物的快速检测。 4 LAMP在病原微生物检测中的应用 4.i 细菌的检测 首先将 LAMP用于细菌检测的是 Maruyama等a，他们用该技术成功检测了大肠杆菌0157：H，细胞中stxA2 基因。Maed等2针对引起牙龈炎的病原菌 16S rRNA基因建立了 LAMP 技术，可在shigo1 r sresei Ww.cn .nei30 min内检测出含有20个细菌的扩增子，产物不 需要进行电泳，只要向扩增产物中添加荧光染料SYBY GreenⅠ，通过肉眼观察直接判定结果，是一种诊断口腔传染性疾病的有效快速诊断方法。朱杰仪等3根据不同血清型副猪嗜血杆菌的 16S rRNA高度保守区域，建立了 LAMP 检测方法，反应可在1h内完成，比PCR敏感100倍。目前 LAMP 还成功地用于特异检测炭疽芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、霍霍弧菌14、肺炎链球菌5等细菌类病原微生物。通过对众多细菌研究结果表明，与传统 PCR 相比，LAMP 技术不仅快速、敏感，而且具有良好的特异性。 4.2 病毒的检测 Enomoto 等6及 Kaneko 等7采用LAMP 方法扩增7型人类疱疹病毒( HHV-7)DNA，并采用焦磷酸镁浊度法进行检测。结果反应30 min后LAMP 的检测灵敏性为每管500拷贝，60 min的灵敏性为每管250拷贝，而 HHV-6A、HHV-6B 和巨细胞病毒(HC-MV)均未出现扩增反应。自用LAMP 成功地检测了人类疱疹病毒之后，又用 LAMP对单纯疱疹病毒8、水痘带状疱疹病毒19、乙肝病毒20实现了检测。 在同一反应管中加入反转录酶和 DNA 聚合酶，还可以对 RNA 病毒进行 RT-LAMP 扩增检测。2009年Hosaka 等利用RT-LAMP 对 HIV-1M组进行检测，扩增反应在35 min内即可完成，检测限达到120拷贝/mL。从57名感染 HIV-1的患者和40名未感染 HIV-1的居民体内收集血浆样品进行 RT-LAMP 分析，结果与预期完全一致。由此可见，RT-LAMP分析在 HIV 诊断上快速灵敏，尤其适用于资源条件不足的环境。此外， ( 参考文献： ) ( [] Notomi T， O kayama H ， Masubuchi H， et al. 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C an J V et Res， ) 对狂犬病病毒2、日本乙型脑炎病毒、马尔堡病毒24、禽流感病毒等进行 RT-LAMP 检测的方法也已建立起来，并得到不断深入的研究。 4.3 寄生虫的检测 原生动物寄生虫是人类重要而常见的病原体：严重危害人类健康。基于 LAMP 技术的特点，其在原生动物寄生虫检测方面也得到了广泛应用。2012年易海华等26针对感染人的4种疟原虫(恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、间日疟原虫)的 18SrRNA基因共有保守序列，建立了定量的环介导等温扩增基因检测方法。该法可特异区分检测上述4种疟原虫与12种相关寄生虫，与 PCR方法相比，LAMP 检测方法的敏感性是其10倍，检出限达到1.42×10拷贝/uL，适合疟疾防治检测的需要。。目前LAMP 广广泛地应用于虫虫、弓形虫28、血吸虫29等的检测。 5 展望 目前 LAMP 技术的研究主要集中在产物检测的方便性和反应速度上，各国科技工作者都在努力提高反应速度、缩短反应时间、找到简便的产物检测方法，以更好地应用于基层临床诊断和现场检测。凭借其操作简单、特异性强、可以在短时间内快速获得大量特异性扩增产物、扩增产物易判断、不需要昂贵的仪器和试剂等优点，LAMP 技术非常适用于临床即时、快速简便的大样本量检测要求，必将成为核酸研究领域的重要工具，在病原微生物检测领域有着非常广泛的应用前景。 ( 2011， 75：122-127. ) ( [4] Qiao J， M eng Q， Ca i X， et al . Ra p id det e ction of Betacoro-navirus 1 f rom clinical f ecal s pecimens b y a no v el re v erse transcription loop-mediated i sothermal a mplification a ssay [. J V e t Diagn Invest， 2012， 24： 1 74-177. ) ( [5] Nemoto M ， Y amanaka T， Bannai H， e t a . 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