果糖-1,6-二磷酸(酯)酶(FBP)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
![image 2022060705384879873](https://www.shlmai.net/upload/ueditor/image/20220607/2022060705384879873.png)
溶液的配制:
1. 试剂一:临用前加入 20 mL 试剂四充分溶解待用,用不完的试剂于 4℃保存。
2. 试剂二:液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加入 1.1 mL 蒸馏水充分溶解待用,用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。
3. 试剂三:液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加入 1.1 mL 蒸馏水充分溶解待用,用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。
产品说明:
果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose 1,6-bisphosphatase,FBP)又称果糖-1,6-二磷酸酯酶,其在糖异生过程和光合作用同化物蔗糖的合成中起关键性的作用。催化1,6-二磷酸果糖和水生成6-磷酸果糖和无机磷。
FBP催化1,6-二磷酸果糖和水,生成6-磷酸果糖和无机磷,在反应体系中添加的磷酸葡萄糖异构酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH,测定340nm下NADPH的增加速率,即可计算FBP活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、天平、低温离心机、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰盒、蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆。于 4℃,8000g,离心 10min,取上清,置冰上待测。
细胞:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min),于 4℃,8000g,离心 10min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 将试剂一37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10min。
3、 操作表:(在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入下列试剂)
![image 2022060705393571978](https://www.shlmai.net/upload/ueditor/image/20220607/2022060705393571978.png)
在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分别加入上述试剂,充分混匀后于 340nm 处测定 10s 时的吸光值 A1,迅速置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴或培养箱 5min(酶标仪有控温功能可直接调节温度),拿出迅速擦干测定 310s 时的吸光值 A2,计算 ΔA 测定管=A2 测定-A1 测定,ΔA 空白管=A2 空白-A1 空白,ΔA=ΔA 测定管-ΔA空白管。(空白管只需做 1-2 次)
三、FBP 酶活性计算
![image 2022060705400590918](https://www.shlmai.net/upload/ueditor/image/20220607/2022060705400590918.png)
注意事项:
1、 当ΔA大于0.6时,建议将样本稀释后再进行测量。
2、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过0.02。
实验实例:
1、 取 0.1g 胰脏组织加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA测定管=A2 测定-A1 测定=0.1957-0.1655=0.0302,ΔA 空白管=A2 空白-A1 空白=0.0779-0.065=0.0129,ΔA=ΔA测定管-ΔA 空白管=0.0302-0.0129=0.0173,按样本质量计算酶活得:
FBP(U/g 质量)=321.5×ΔA÷W=321.5×0.0173÷0.1=55.6195 U/g 质量。
2、 取 0.1g 黑麦草加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA测定管=A2 测定-A1 测定=0.7224-0.6267=0.0957,ΔA 空白管=A2 空白-A1 空白=0.0779-0.065=0.0129,ΔA=ΔA测定管-ΔA 空白管=0.0957-0.0129=0.0828,按样本质量计算酶活得:
FBP(U/g 质量)=321.5×ΔA÷W=321.5×0.0828÷0.1=266.202 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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