导电性调节的双极电化学发光传感平台解决方案

一、实验目的该方案旨在开发一种基于导电性调节的双极电化学发光（The bipolar electrode based ECL，BPE-ECL）传感平台，用于无指示剂的均相生物分析。该平台通过导电性生物传感技术与ECL报告系统的结合，实现了在无需外源电活性指示剂的情况下进行目标检测。研究以miRNA-21的检测为示范，探索该方案的可行性和应用前景。二、实验使用的仪器设备和耗材试剂1. 仪器设备超微弱发光分析仪：BPCL-2，结合光电倍增管（PMT）操作电压为-800V，用于测量ECL发光强度。电化学工作站：用于施加电位。电导率仪：用于测量溶液的电导率。电泳仪：用于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），验证核酸杂交链式反应（HCR）。生物分子成像仪：用于电泳结果成像。2. 耗材试剂聚二甲基硅氧烷（PDMS）：用于制作传感和报告池。Ru(bpy)32+和TPrA：作为ECL检测体系的核心试剂。氯金酸（HAuCl4）：用于电极金属化处理。合成核酸：由Sangon Biotech提供，包括探针DNA、H1、H2及目标miRNA-21等。人乳腺癌细胞：用于miRNA-21的实际应用检测。超纯水：18.2 MΩ·cm，作为所有实验的溶剂。三、实验过程1. BPE传感器的制作(1). ITO玻璃板的准备：从供应商处采购电阻小于6Ω/平方的ITO玻璃板，并在其上制作导电BPE，确保传感池包含BPE的阴极和驱动电位的阳极，而报告池包含BPE的阳极和驱动电位的阴极。(2). 电沉积金：为了提高导电性，分别在BPE的阴极和驱动电位的阴极上进行金电沉积。2. 杂交链式反应（HCR）的进行(1). 反应混合：在超纯水中混合探针DNA、H1和H2，浓度分别为0.5 μM、5 μM和5 μM。(2). 目标miRNA-21的添加：将不同浓度的miRNA-21加入混合物中，37°C孵育2小时以进行HCR反应。3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）验证：(1). 电泳条件：在TBE缓冲液（1×）中，恒定电压80V，室温下进行2小时电泳。(2). 成像分析：使用生物分子成像仪拍摄凝胶，以验证探针DNA、H1和H2的杂交情况。4. BPE-ECL传感检测(1). 准备工作溶液：在报告池中加入200μL含有5mM Ru(bpy)32+和5mM TPrA的PBS缓冲液（0.1 M，pH 7.0），在传感池中加入HCR孵育后的样品。(2). ECL测量：使用循环伏安法，电位范围为1.0-4.5V，扫描速率为100 mV/s，进行ECL测量。每个样品测量三次，计算标准偏差。四、实验结果与讨论1. HCR反应和导电性变化的验证(1). PAGE分析（图1A）：短核酸（探针、H1、H2）在低分子量位置显示荧光带，而miRNA-21诱导的核酸聚合物在高分子量位置显示。这验证了目标miRNA-21触发了探针、H1和H2的杂交反应。(2). 导电性测量（图1B）：混合短核酸后溶液的导电性显著增加，而加入miRNA-21后，导电性显著下降。这表明生成的长核酸聚合物导电性较差。(3). ECL测量（图1C）：ECL强度在短核酸（22 bp）溶液中显著高于长核酸（1250 bp），进一步验证了导电性对BPE-ECL系统的重要影响。(4). ECL响应的验证（图1D）：相较于无miRNA-21存在的情况（曲线g），miRNA-21存在时ECL响应显著降低（曲线h），因为miRNA-21诱导的HCR生成了导电性较差的核酸聚合物。图1. (A) PAGE分析: (a-c通道) 探针、H1、H2；(d通道) H1 + H2；(e通道) 探针 + H1 + H2；(f通道) 探针 + H1 + H2 + miRNA-21。(B) 对应PAGE相同条件下的导电性比较。(C) 5 μM短链（22 bp）和长链（1250 bp）核酸溶液的ECL响应比较。(D) BPE-ECL生物测定在无miRNA-21 (g) 和有1 pM miRNA-21 (h) 情况下的ECL响应。2. 分析条件的优化(1). 探针浓度（图2A）：ECL强度差值（ΔECL）随着探针浓度的增加而增加，在浓度超过0.5 μM后达到平台期。因此，选用0.5 μM作为最佳探针浓度。(2). H1/H2浓度（图2B）：随着H1/H2浓度的增加，ΔECL响应持续增强，在5 μM时达到饱和，表明5 μM为最佳H1/H2浓度。(3). 温度（图2C）：ΔECL响应随着温度升高至37°C后增加，随后略有下降，表明最佳反应温度为37°C。(4). 反应时间（图2D）：ΔECL响应随HCR反应时间的延长而增加，在120分钟后达到最大，选择120分钟作为最佳反应时间。图2. (A) 探针浓度，(B) H1/H2浓度（[H1]:[H2] = 1:1），(C) 温度，和 (D)反应时间对ΔECL响应的影响。所有实验中的miRNA-21浓度均为1 pM。3. 传感系统的性能评估(1). 检测限与线性范围（图3）：不同浓度miRNA-21的ECL响应如图3A所示。ECL强度与miRNA-21浓度的对数呈良好线性关系（图3B），线性范围为1 fM至10 nM，检测限为0.33 fM。图3. (A) 不同浓度miRNA-21的ECL响应: (a−i) 空白, 1 fM, 10 fM, 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM, 10 nM。(B) ECL强度与miRNA-21对数浓度之间的线性关系。(2). 选择性（图4A）：高结构类似物（miRNA-122、miRNA-141、miRNA-155）的检测结果表明，BPE-ECL传感系统对miRNA-21具有良好的特异性。(3). 稳定性和重复性（图4B, 4C）：ECL信号在八次重复测量中稳定，RSD为2.56%，三种不同浓度miRNA-21的RSD分别为3.2%、2.4%和1.4%，表明系统具有良好的稳定性和重复性。(4). 实际应用（图4D）：检测不同数量MCF-7细胞裂解液中的miRNA-21，ECL信号随细胞数量增加而下降，验证了该传感平台在临床样品检测中的应用潜力。图4. (A) 不同miRNA类似物的ECL响应，miRNA-122、miRNA-141和miRNA-155浓度为10 pM，miRNA-21浓度为1 pM。 (B) BPE-ECL生物传感平台的稳定性。 (C) BPE-ECL传感器对不同浓度miRNA-21响应的重现性。 (D) 不同数量MCF-7细胞裂解液的ECL响应。五、结论本方案提出了一种基于导电性调节的BPE-ECL生物传感平台，该平台利用目标miRNA-21诱导的HCR反应生成长链核酸聚合物，导致传感池导电性降低，进而减少报告池的ECL信号输出。该平台具备传统BPE-ECL传感器的优点，通过物理分离传感和报告反应有效避免了干扰，且无需外源电活性指示剂。该方案简单、灵敏、快速，并在实际样品检测中表现出良好的应用前景。未来，该方案有望进一步应用于包括DNA、小分子、蛋白质、细胞和细菌等多种目标的定量和定性检测。*因学识有限，难免有所疏漏和谬误，恳请批评指正*资料出处： 免责声明:1.本文所有内容仅供行业学习交流，不构成任何建议，无商业用途。2.我们尊重原创和版权，如有疏忽误引用您的版权内容，请及时联系，我们将在第一时间侵删处理！