实验方案：微滴/微球制备仪制备透明质酸(HAMA)微球

实验目的本实验方案通过利用微滴/微球制备仪，以Drop-Surf微滴生成油为油相，以2%透明质酸(HAMA)溶液(含0.2% LAP作为光引发剂)为水相制备高单分散的微滴，并通过405 nm紫外光照射实现微滴的固化，最终获得具有极高单分散性的透明质酸(HAMA)微球(CV<5%)。引言透明质酸(HA)是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基葡萄糖作为双糖结构单元的天然糖胺多糖聚合物，主要存在于脊椎动物的细胞外基质、玻璃体液和滑液中[1,2]。因其独特的生物和理化性质及安全性，透明质酸在医药、食品和化妆品等领域都有广泛应用[3,4,5]。然而，游离的透明质酸在人体内易被酶降解[6]，这大大限制了其应用。目前已有多种方法增强透明质酸的机械性质，以延长其在体内的停留时间，如使用1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(EDC)、二乙烯砜(DVS)等交联剂对其进行改性处理[7,8,9]，生成薄膜、微球、海绵、微针等不同形态的透明质酸。其中，透明质酸微球因其独特的球形结构和易注入特性，常用于药物递送、细胞递送、软组织填充等方面。在这些应用中，透明质酸微球的尺寸和理化性质极大程度影响载药效果、药物释放率和填充效果[1]。因此，制备一种尺寸可控、理化性质可调的单分散透明质酸微球是实现以上应用的关键。目前，制备透明质酸微球的主要方式有乳化-凝固法和喷雾干燥法[10,11]。搅拌法和喷雾干燥法具有操作简单便捷等优点，但其制备的透明质酸微球均一性差。而采用液滴微流控技术，可制备粒径高度均一可控的透明质酸微滴，从而固化形成高单分散性的透明质酸微球。Shendi等人首先用DVS对HA修饰改性，然后采用液滴微流控技术制备VS-HA液滴，在紫外灯照射下交联形成凝胶化的透明质酸水微球。然而，这种方法需要DVS修饰透明质酸，而DVS具有一定毒性，可能会引起人体炎症和水肿等副作用[12]。Yuk等人以聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDE)作为交联剂实现透明质酸微球的化学交联，然而因其难以渗透至微球内部，交联效果不尽如人意[13]。因此，找到一种无害高效的交联剂和简便的透明质酸改性方法，对于制备生物相容性好、理化性质可调节、单分散性好的透明质酸微球具有重要意义。基于此，FluidicLab使用甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)，以苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)作为光引发剂，采用液滴微流控技术，通过微滴/微球制备仪制备高度均一的透明质酸微滴，再在紫外灯照射下实现微滴的固化，最终得到透明质酸微球。该法操作简便，样品利用率高，制备得到的微球单分散性高(CV<5%)，具有较好重复性。实验材料试剂微滴生成油 (Drop-Surf, FluidicLab)破乳剂 (Drop-Surf, FluidicLab)甲基丙烯酰化透明质酸 (HAMA, FluidicLab)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐 (LAP, FluidicLab)耗材15 mL离心管(Falcon 15 mL REF 352097)若干1.5 mL黑色离心管和透明离心管若干内/外径0.25 /1.6 mm PEEK管及所需接头10 mL棕色玻璃瓶若干0.22 μm针式过滤器(PTFE材质)若干2 mL注射器若干1.8 mL避光样品管芯片夹具PDMS-FF-100芯片（FluidicLab）PDMS标准芯片夹具设备Fluidiclab微滴/微球制备仪(两通道)电脑(Win10 以上系统)辅助设备高速离心机(湖南湘仪, H1850)普通光学显微镜(用于测微球粒径)超声波清洗机(语盟，YM-020T)常规紫外灯(405 nm光源)电子分析天秤(力辰科技)实验步骤1. 试剂准备(1) 4% 透明质酸(HAMA)水溶液(w/w)配制称取0.04 g HAMA粉末，加入0.96 g超纯水，避光超声振荡溶解。(2) 0.2% LAP水溶液(w/w)配制称取0.010 g LAP粉末，加入4.99 g超纯水，避光超声振荡溶解。(3) 2% 透明质酸(HAMA)水相溶液(含0.2% LAP)配制取400 μL 4%透明质酸溶液，200 μL 0.2% LAP溶液，加入200 μL超纯水，避光振荡均匀，并用0.22 μm针式过滤器过滤。2. 微滴制备：(1) 微滴/微球制备仪的安装连接微滴/微球制备仪安装连接参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“2. 微滴/微球制备仪的安装连接”的部分；其连接如下(步骤③-⑦连接效果如下图所示)：① 用气管依次连接“空气压缩机”--“气源处理装置”--“微滴/微球制备仪”；② 将微滴/微球制备仪分别与电源、电脑的连接；③ 用气管分别将A0(压力输出通道一)和A1(油相15 mL储液池)，B0(压力输出通道二)和B1(水相1.5 mL黑色离心管储液池)连接；④ 用配有1/4-28螺纹接头和卡箍的PEEK管(内/外径 0.25 mm/1.6 mm)分别将A1(油相15 mL储液池)和A2(通道一流量传感器)，B1(水相1.5 mL黑色离心管储液池)和B2(通道二流量传感器)连接；⑤ 用配有1/4-28螺纹接头和卡箍的PEEK管(内/外径 0.25 mm/1.6 mm)分别将A2(通道一流量传感器)和A3(PDMS芯片的油相入口)，B2(通道二流量传感器)和B3(PDMS芯片的水相入口)连接；⑥ C为标准PDMS芯片和夹具的组合，芯片和夹具的入口通过硅胶塞密封；⑦ 用PEEK管(内/外径 0.25 mm/1.6 mm)将芯片出口D处生成的乳液导出。(2) FluidicLabSuite软件的安装和设备的添加：FluidicLabSuite软件的安装参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“3.1 FluidicLabSuite软件的安装”的部分；(3) 透明质酸(HAMA)微液滴的制备具体操作步骤如下：① 分别在15 mL油相储液池(通道一)和1.5 mL水相黑色离心管储液池(通道二)中依次加入5 mL微滴生成油和1 mL 配制好的水相溶液；② FluidicLabSuite软件的设备添加参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“3.2 FluidicLabSuite软件的设备添加”的部分(相机和流量传感器仅需添加一次)；③ 打开空气压缩机和气源处理装置开关；④ 在乳液出口端放置离心管接收微滴稳定前的废液；⑤ 在电脑端设置通道一压力(油相，如150 mbar)和通道二压力(水相，如700 mbar，水相黏度大，流阻大，压力更大)排出管路和芯片中的空气；⑥ 待管路和芯片中完全填充液体后(空气被完全排出)；将整个系统由压力控制切换到流速控制，并设置通道一(油相)和通道二(水相)流速分别为7.5和10 μL/min；⑦ 调整反馈值(Feedback)快速达到设定流速，并实现流速的稳定输出；⑧ 用疏水培养皿接收一滴乳液，并在普通光学显微镜下观察其微滴的均匀性；⑨ 待微滴生成均匀后，即可开始接收至透明的1.5 mL离心管中；⑩ 20 min后停止收集，密封于离心管中，用405 nm紫外灯照射5 min固化。3. 透明质酸微球的破乳清洗：具体操作步骤如下：① 去除1.5 mL离心管底部微滴生成油(微滴生成油密度大于水相，在离心管底部)；② 按V球：V破=1:2 加入破乳剂，振荡破乳；③ 1000 rpm离心处理1 min，并去除底部破乳剂(破乳剂密度大于水，在离心管底部)；④ 重复上述②和③操作；⑤ 在离心管中加入PBS缓冲液，振荡离心多次洗涤处理(离心处理微球在离心管底部)；⑥ 最终得到固化后的透明质酸微球，分散在PBS缓冲液中。注意：若含有球的水相中仍有部分油乳液存在，可通过细胞筛过滤去除油的乳液或者离心后从上部取出含有微球的水相。4. 微滴/微球制备仪清洗：微滴生成仪每次使用完必须清洗管路、流量传感器和芯片。具体操作详见“微滴/微球制备仪操作指导卡”。结果与讨论：刚接收的微滴平均粒径为105.05 μm，具有极高的单分散性(变异系数: CV=1.29%)。其显微镜图和粒径分布如下图所示：最终获得的透明质酸微球平均粒径为120.59 μm，具有极高的单分散性(变异系数: CV=3.05%)。其显微镜图和粒径分布如下图所示：实验关键要点：1. 采用本方案制备透明质酸微球时，由于2%(wt%)透明质酸黏度大于Drop-Surf微滴油，因此在同样流速下，挤压水相所施加的压力大于油相的压力，具体可参考本方案所对应的视频(压力数值仅供参考)；2. 水相溶液在配制和使用时必须避光操作，须使用棕色或黑色离心管；3. 微球是否固化须通过显微镜观察确认，若显微镜下观察无微球，则很有可能是液滴没有实现固化。参考文献：[1] Long Y. 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