移液工作站在猪瘟夹心ELISA抗体检测中的应用

猪瘟夹心ELISA抗体检测步骤猪科动物是ASFV的易感动物。家猪和欧亚野猪对ASFV高度易感,且表现出相似的临床症状和死亡率;而非洲野猪,例如疣猪、丛林猪、红河猪和巨林猪,感染ASFV后很少或者不出现临床症状,是病毒的储存宿主。一、实验试剂1、酶标抗原:辣根过氧化物酶标记的重组P54蛋白3、对照:ASFV阳性对照血清、ASFV阴性对照血清。4、包被缓冲液--0.05 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液（配制方法：  Na2CO3  0.318g；NaHCO3  0.588 g；去离子水200 mL 用0.22m膜过滤除菌,室温保存备用。）5、 封闭缓冲液(含2%BSA的pH7.4PBS ) （配制方法： pH7.4 PBS  1 000 ml ；BSA 20 g；现配现用）6、稀释缓冲液(含1%BSA的pH7.4 PBS) （配制方法：pH7.4 PBS 1 000 mL；BSA  10 g 现配现用）6、 洗涤缓冲液--PH7.4PBST(0.05%吐温-20)（配制方法：pH7.4 PBS 1 000 mL；吐温-20 0.5 ml  现配现用）7、 TMD底物溶液（配制方法：底物溶液A:TMB 200 mg；无水乙醇 100 mL；蒸馏水加至1000ml。  底物溶液B:磷酸氢二钠(NazHPO4:,分析纯) 71.7 g；柠檬酸(C6H8O7,,分析纯)9.33 g；0.75%过氧化氢尿素 6.4 mL；加蒸馏水至1000 m,调整pH值至 5.0~5.4。将底物溶液A和底物溶液B按1:1混合,现配现用）8、终止液(2 mol/1 硫酸)（配制方法：111m分析纯浓硫酸缓慢逐滴加入889m去离子水中,室温分装保存）二、仪器设备1、酶标仪。 2、恒温孵育箱。3、洗板机或洗涤瓶。4、96孔酶标板。5、96孔U型底孔板1块 ICF-PS-96U-S6、24道多功能移液工作站（十二板位）FDT-M24-12-3007、4道储液槽60ml 1个 RES-60-48、封板膜 FDT-CP309、200μl吸头一盒 PE-200A-1-TSF包被酶标板ASFV重组P54蛋白用包被缓冲液稀释至终浓度为0.1g/mL,按每孔100L的量包被96孔酶标板,37℃饱和湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次后拍干,300μL/孔加入封闭缓冲液,37℃饱和湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次后拍干。三、实验步骤（图片仅为实验模拟图）1、酶标板上对照和样品的分布图,见下图。在A1和B1孔加入ASFV阳性对照血清各50μL,在C1和D1孔加入ASFV阴性对照血清各50μL;剩余孔中加入待检样品血清50 μL。样品加样记录表12356789101112APBPCNDNEFGH说明：P为阳性血清对照孔N为阴性血清对照孔空白为待检血清孔2、轻轻振匀孔中样品(勿溢出),37℃孵育20min。3、 甩干ASFV抗原包被板孔中的液体,每孔加入300μL洗涤缓冲液,洗涤5次,在洗涤和加入下一个试剂前,避免孔壁变干。4、 每孔加入50μL的酶标抗原(1x);37 ℃孵育20 min。5、甩干ASFV抗原包被板孔中的液体,每孔加入300μl,洗涤缓冲液,洗涤5次,在洗涤和加入下一个试剂前,避免孔壁变干。6、每孔加入50μL底物溶液A和50μL底物溶液B;37 ℃避光孵育10min。8、 每孔加入50μL终止液终止显色反应;使用酶标仪测定450nm波长处的OD值。四、试验成立条件OD450-NC值≤0.15且OD450-PC值≥0.6,试验结果有效;否则重新进行试验。注:阴性血清的平均OD值即为OD450-NC;阳性血清的平均OD值即为OD450-PC。5、 夹心ELISA抗体检测结果判定Cut Off值按公式计算:Cut Off=OD450-s-OD450-NC式中:OD450-s --待检血清样品 OD450值;OD450-NC--阴性对照血清 OD450值。在试验成立的前提下,Cut Off值≤0.15,则判为ASFV抗体阴性:Cut Off值>0.15,则判为ASFV抗体阳性。广州市程淇生物技术有限公司GuangzhoulCF Biotech Co.,Ltd   邮  箱:info@icfbio.com热线电话:400-168-3986        网址:www.icfbio.com公司地址:广州市花都区花港大道盛丰工业区87号4栋3楼