警惕！身体中的尼古丁！血浆中可替宁和 3-羟基可替宁UHPLC-MSMS同时测定法

众所周知，吸烟和二手烟对身体伤害极大！危害包括增加肺癌的发病率、导致不孕或胎儿畸形、容易骨质疏松等。2020年，中国疾病预防控制中心，对北京、上海、深圳等六城市的餐饮场所工作人员进行了大规模的研究调查，经检测即使是已出台全面无烟立法城市，可替宁检出率34.12%，三羟基可替宁检出率16.32%；未出台全面无烟立法城市，相应指标更高，可替宁检出率68.04%，三羟基可替宁检出率41.94%。（数据来源：中华预防医学杂志，年,卷(期)：2021,55(12)）如此高的检出率！烟草烟雾暴露，成为一个不容忽视的重要社会问题。尼古丁是烟草中含量最高的生物碱，在人体内半衰期较短，其70%～80%代谢产物为可替宁。当接触烟草烟雾后，在人体的不同生物样本基质中均可检测出可替宁。可替宁在人体中可进一步代谢为3-羟基可替宁，因此，可替宁和3-羟基可替宁可作为烟草烟雾暴露的生物标志物。可替宁3-羟基可替宁为了您和家人身体健康，远离吸烟和二手烟。血浆中可纳鸥科技助力尼古丁代谢产物在人体内的检测，本应用在检测血浆中可替宁和羟基可替宁的基础上，对样本前处理流程、液相色谱分离条件进行了优化，建立了检测血浆中可替宁和羟基可替宁的检测方法。一、摘要:目的  建立血浆中可替宁和 3-羟基可替宁的固体介质液液萃取-超高效液相色谱-串联质谱同时测定法。方法  在血浆样品中加入同位素内标和氢氧化钾后,使用 96孔SLE液液萃取板净化,净化液经异丙醇二氯甲烷溶液洗脱、氮气吹干,纯水复溶,使用Anavo XP C18色谱柱(100 mmⅹ2.1 mm,1.7 µm)，以 0.1%氨水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱,使用多反应监测模式采集数据。结果  可替宁和羟基可替宁在0.1~300 ng/ml线性范围内方法线性良好（r＞0.999）,可替宁方法定量下限为0.03 ng/ml,三羟基可替宁方法定量下限为0.02 ng/ml。可替宁的加标回收率为95.0%~99.4%,RSD为2.1%~3.3%。三羟基可替宁的加标回收率为95.8%~97.4%，RSD为2.1%~4.2%。结论  该方法取样量少、操作简便、方法精密度高,适合大规模样品的筛查检测工作。二、测定原理可替宁、3-羟基可替宁通过同位素稀释高效液相色谱质谱方法测量。向血浆（清）样品中加入甲基-D3-可替宁、反式3-羟基可替宁-D3作为内标，样品碱化然后加入到液体提取盘（SLE)）中。分析物被混合的异丙醇和二氯甲烷提取，浓缩，剩余物复溶后进样到C18色谱柱上，洗脱液洗脱，LC-MS测定。可替宁的母离子为m/z 177，子离子为m/z 80，3-羟基可替宁的母离子为m/z 193，子离子为m/z 80。内标和离子对配合各自的监控化合物。以标准系列峰面积与内标峰面积之比和可替宁、3-羟基可替宁浓度，做工作曲线。三、实验过程1、仪器与试剂液相色谱串联质谱Anavo 96孔板正压固相萃取装置（PN：AN25D021）Anavo 96孔板氮吹仪（PN:AN25D020）Anavo SLE+ 400mg 96孔板(PN: AN25H007)Anavo 2m深孔96孔板收集盘（PN: AN25J017）Anavo XP杂化硅胶UHPLC C18色谱柱（PN：AN80A006）12通道300µL移液器漩涡振荡器冰醋酸、醋酸铵、氢氧化钾：优级纯异丙醇、甲醇、二氯甲烷：色谱纯2、标准物质可替宁：100µg/mL、 3-羟基可替宁：100µg/mL， 甲基-D3-可替宁: 100µg/mL、反式3-羟基可替宁-D3: 100µg/mL3、标准曲线的配制    准确称取适量的COT和HC标准溶液溶于纯水，得到0.10、0.30、0.50、1.00、3.00、5.00、10.00、30.00、50.00、100.00、300.00 ng/ml的COT和HC标准系列溶液，含D3-COT和D3-HC内标浓度为20.0 ng/ml。以COT、HC定量离子峰面积与相应内标物定量离子峰面积之比对COT、HC标准溶液浓度绘制标准曲线。4、样品前处理准确吸取 200 μl样本（高浓度样本吸取50 μl血浆+纯水150 μl），依次加入50 μL的0.2 mol/L 氢氧化钾溶液、50 μl的D3-COT 和 D3- HC 混合内标溶液到 96 孔混合盘中，使用排枪抽吸混匀。将上述混合溶液全部转移至SLE提取盘中，放置5 min。加入0.3 ml 的5%异丙醇二氯甲烷混合液，放置5 min后，使用96孔正压固相萃取装置以3.5 psi氮气压20 s（该流程重复6次）。合并洗脱液于96孔板收集盘中，放置于96孔氮吹仪上用氮气吹干，吹干后加入100 μl纯水复溶，盖上密封垫，漩涡混匀后上机检测。5、LC-MS-MS测定1）HPLC的条件和参数分析柱：Anavo XP C18, 1.7µm, 2.1*100mm（PN：AN80A006)流动相：0.1%氨水-乙腈梯度洗脱条件：见表1。进样量：5 μl流速：300 μl/min柱温：40 ℃表1 梯度洗脱条件（体积分数）2）质谱条件电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描，喷雾电压：4500 V；离子源温度：550 ℃，碰撞气压力：中性碰撞气；气帘气压力：0.24 MPa；雾化气压力（GS1）和辅助加热器压力（GS2）：0.38 MPa。多反应监测（MRM）模式采集。其他质谱参数见表1。表2 质谱条件可替宁色谱图3-羟基可替宁色谱图配套关键耗材特色产品推荐：BioSin 96孔板氮吹仪