使用 Agilent 6475 三重四极杆液质 联用系统测定亚硝胺杂质

摘要亚硝胺杂质是药品生产过程中产生的痕量副产物。这些杂质被归类为潜在遗传毒性杂质，长期摄入可能致癌。因此，以高灵敏度和可靠性测定它们在成品药中的含量水平非常重要。本应用简报评估了 Agilent 6475 三重四极杆 LC/MS (LC/TQ) 系统、Agilent 1290 Infinity II 生物液相色谱系统和大气压化学电离 (APCI) 离子源组合对8 种亚硝胺杂质的定量性能。作者 Linfeng Wu 和 Lee Bertram 安捷伦科技 有 限公司 美国加利福尼 亚 州圣克拉拉市 Shan-An Chan 安捷伦科技有限公司 中国 台 湾 使用 Agilent 6475 三重四极杆液质 联用系统测定亚硝胺杂质 亚硝胺杂质是药品生产过程中 产 生的痕量副产物。这 些 杂质被归类为潜在遗传 毒 性 杂质,长期摄入可能致癌。因此,以高灵敏 度 和可 靠 性测定它 们 在成品药中的含 量 水平 非 常重要。本应用简报评估 了 Agilent 6475 三重 四 极杆 LC/MS (LC/TQ) 系统、Agilent 1290 Inf i nity l l 生物液相色谱系统和大气压化学电离(APCI) 离 子 源组合对 8种亚硝胺杂质的定量性能。 前言 最 近宣布召回部分血管紧张素Ⅱ受 体阻滞剂 (ARB)药物,使亚 硝 胺 杂质成为监管机构关注的重点 。亚硝胺杂质 是 药品生产 过 程中的副产物。它们属于“关注队列”,被 归 类为潜在遗传 毒性杂质,长期摄入可能致癌。 本应用简报通过 6475 LC/TQ 联用1290 Infinity ll生物液相色 谱系统和 APCI 离子源对8种亚硝胺化合物进行了全面分析。 结果表明,该联用系统可以测 定 低浓度的以下化合物: –N-亚硝基二甲胺 (NDMA) –N-亚硝基吗啉 (NMOR) –N-亚硝基甲基乙胺(NMEA) –N-亚硝基吡咯烷 (NPYR) –N-亚硝基 二 乙胺 (NDEA) –N-亚硝 基 哌啶 (NPIP) –N-亚硝 基二 正丙胺 (NDPA) –N-亚硝基二正丁胺 (NDBA) 试剂与标准品 分析中使用的所有试剂和溶剂均为 LC/MS 级。超纯水产 自配备 LC-Pak Polisher 和 0.22 um 膜 式 终端过滤器滤芯的 Milli-Q Integral 系 (MilliporeSigma, Billerica, MA, U.S.)。含 有8种亚硝胺 (NDMA 、NDEA、NMOR、NMEA、NPYR、NPIP、NDPA 和NDBA)的标准品来 自 于安捷伦(货号 US-113N-1)。 样品前处理 将 亚硝胺标准 品 以9种不同的浓度加入溶剂空白(10:90 甲 醇:水)中,加标浓度范围为 0.0125-10 ng/mL。按以下步骤 处理活性药物成分 (API) 基 质:将100 mg 氯沙坦钾药品溶于 2 mL 溶剂 (50:50甲醇:水)中,超声处理30分钟。然后,样 品在 12000 rpm 下离心10分钟。收集上清液,用水按 1:5的 比例进行稀释。将亚硝胺标准品加入处理后的API基质中,加 标浓度范围为 0.05-1ng/mL。 设备 使用 Agil ent 1290 I n f in it y ll 生 物液相色谱系统 进 行样品分离,该系统由以 下 模块组成: –Agilent 1290 Infinity II 物生物高速 (G7132A) –四备恒温箱的 Agilent 1290 Infinity II 生物 Multisampler (G7137A) –Agilent 1290 Infinity II 容高容量柱温 (G7116B) 该液相色谱系统与配备安捷伦 APCI 离子源 (G1947B) 的 A gilent 6475 三重四极杆液质联用系统 (G6475AA) 联用。使 用 Agilent MassHunter Workstation 软件 12.0进行数据采集。 方法 液质联用 (LC/MS) 系统条件和参数如表1和表2所示。化合 物的多反应监测 (MRM) 设置如表3所示。使用忽略原点的线 性 拟合以及 1/x加权进行校准曲线分析。 表 1. Agilent 1290 Infinity II 生物液相色谱系统方法 参数 数值 色谱柱 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18,3.0 × 150 mm, 2.7 µm (货 693975-302) 进样器温度 4 °C 流动相A ddH2O + 0.1%甲酸 流动相B 甲醇+0.1%甲酸 流速 0.5 mL/min 进样量 20 µL 柱温 40 °C 梯度程序 时间 (min) %B0.0 53.5 57.0 459.0 6011.0 6015.0 6516.0 9016.1 520.0 5 表 2. Agilent 6475 LC/TQ 参数 参数 数值 离子源 安捷伦 APCI 离子源 极性 正离子 气体温度 300 °C 干燥气流速 7 L/min 雾化器 25 psi APCI气化温度 350 °C 毛细管电压 4000 V 电晕电流 4.0 µA 扫描类型 基于时间段的 MRM 方法 检测器增益因子(+) 10 液相流转移至废液 0–2 min 12–13 min 14–18 min (其余时间转移至 MS) 表 3. Ag il ent 6475 L C /TQ 的详 细 多反应监 测 (MRM) 设 置和 化合 物信 息 化合物名称 母离子m/z 子离子m/z 驻留时间(ms) 碎裂电压(V) 池加速电压(V) 碰撞能量(V) 极性 实测保留时间(min) NDMA 75 43 50 95 3 16 + 2.51 75 58 50 95 3 10 + 2.51 NMOR 117 45 50 80 4 21 + 3.99 117 87 50 80 4 11 + 3.99 NMEA 89 43 50 75 3 12 + 5.35 89 61 50 75 3 10 + 5.35 NPYR 101 41 50 90 3 24 + 5.70 101 55 50 90 3 19 + 5.70 NDEA 103 47 50 80 4 20 + 7.48 103 75 50 80 4 12 + 7.48 NPIP 115 41 50 90 3 24 + 7.90 115 69 50 90 3 12 + 7.90 NDPA 131 43 50 80 4 10 + 10.10 131 89 50 80 4 16 + 10.10 NDBA 159 41 50 80 3 20 + 13.50 159 57 50 80 3 12 + 13.50 校准曲线分析 为了 评估 对 亚 硝胺的定 量 性能,分析了溶剂中浓度范围为 0.0125-10 ng/mL 的8种亚硝胺化合物的校准曲线。 分析结果汇总如下: 一 月 所有分析物均获得良好的色谱分离和峰形(图1)一 月 所有测试浓度下 均 具有出色的精密度和准确度,包括定量 下限(LLOQ)(表4) 一月 LLOQ ≤ 0.025 ng/mL 度(表4) 一在 在测试浓度 下 ,8种分析物均获得出色的定量线 性 , R2 > 0.99(( 2) 采集 时 间 (min) 图1.1ng /m L 下 8种 亚硝 胺化 合 物的 总 MR M 色 谱 图 表 4.使 用 Agilen t 6475 L C/T Q系统 ,在0.025和0.05 ng/mL 下 获得 的平 均 响应 、定 量 离 子 信 噪 比 (S/N)、%R SD和 准 确 度(%)(n=3) 浓度 0.025 ng/mL (n = 3) 0.05 ng/mL (n = 3) LLOQ*(ng/mL) 名称 响应 信噪比 RSD (%) 准确度(%) 响应 信噪比 RSD (%) 准确度(%) NDMA 1145.08 14.63 1.28 113.86 2154.26 23.08 1.07 105.41 0.025 NMOR 328.76 52.40 15.94 104.90 705.55 105.41 14.94 103.87 0.025 NMEA 1057.38 40.79 3.86 116.86 1909.29 91.84 4.81 101.00 0.0125 NPYR 918.54 24.31 2.65 115.47 1697.56 41.59 2.45 89.61 0.025 NDEA 382.15 31.11 8.14 107.67 606.87 52.10 8.58 87.91 0.025 NPIP 890.01 57.47 6.46 97.45 2106.81 111.72 5.30 98.29 0.025 NDPA 795.93 95.62 12.01 106.13 1647.60 177.47 10.77 95.97 0.025 NDBA 892.36 67.66 7.58 112.05 1581.52 123.78 7.83 101.33 0.025 * LLOQ 为定量离子 S/N > 10 定性离子 S/N > 3 RSD < 20%, 准确度 80%–120% × 105 图 2. Ag il ent 6475LC/TQ 上 8种亚硝胺化合物在 0.0125-10ng/m L 浓 度 范围 内 的 校准曲线 氯沙坦钾药物基质中的定量 为了 评 估药品中亚硝胺杂质的分析性能,将亚硝胺标准 品 以 0.05-1 ng/mL 的浓度加标至氯沙坦钾药物提取物中。结果表 明,在药物基质中加标浓度为 0.05 ng/mL 的条件下,8种哑 硝胺化合物均实现高度 可 靠的定量。8种分析物的分析灵敏度 均远优于监管机构规定的亚硝胺可接受含 量 23。 NDMA 是亚硝胺杂质分析中常见的挑战性化合物。图3所示 为基质空白和 10 mg/mL 药物提取物中加标浓 度 为0.05和 0.1 ng/mL 的 NDMA 的代表性重复测定叠加色谱 图 。结果表 明, 6475 LC/TQ 为药物基质中低浓度的 NDMA 提供了出色的 响应、S/N和重现性。 采集 时 间(min) 图3.氯 沙坦钾 药 物 基 质中 低浓度 NDMA 子 离 子的重复 测定 叠 加色 谱 图 本应用简报表明, Agilent 6475 三重 四极杆液质联用系统可以 在法规规定的低浓度水平下可靠定量亚硝胺杂质 。该方法可用 于不同 ARB 药品中上述 杂 质的定量,并可根据药品的洗脱模 式改变色谱条件。 查 找当 地 的安捷伦客户 中 心: www.agilent.com/chem/contactus-cn 免 费专线: 800-820-3278,400-820-3278(手机用户) 联系我们 : LSCA-China_800@agilent.com 在线询价: www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com DE41584454 本文中的信息、说明和指标如有变更,恕不另行通知。 参考文献 1. U.S. Food and Drug Administration. FDA Updates and Press Announcements on Angiotensin II Receptor Blocker(ARB) Recalls (Valsartan, Losartan, and Irbesartan). Last revised March 2023. https://www.fda.gov/drugs/drug-safety-and-availability/fda-updates-and-press-announcements-angiotensin-ii-receptor-blocker-arb-recalls-valsartan-losartan 2. Center for Drug Evaluation and Research, U.S. Food and Drug Administration, Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs: Guidance for Industry. Last revised February 2021. Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs|FDA. https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/control-nitrosamine-impurities-human-drugs 3. Committee for Medicinal Products for Human Use, European Medicines Agency. Procedure under Article 5(3) of Regulation EC (No) 726/2004. Procedure number:EMEA/H/A-5(3)/1490. Nitrosamines Impurities in Human Medicinal Products. Last revised June 2020. Nitrosamines EMEA-H-A5(3)-1490 - Assessment Report (europa.eu)