解决方案|液相色谱法测定水溶肥料中游离氨基酸含量

氨基酸的含量在氨基酸水溶肥料中尤为重要。农业标准NY 1429-2010中规定了氨基酸有机肥（液体）的含量不低于100g/L，农业标准《水溶肥料游离氨基酸含量的测定》NY/T 1975-2010中对氨基酸的检测方法做了推荐，分别是氨基酸自动分析仪法和柱前衍生-液相色谱仪法。本文参考NY/T1975-2010，建立了柱前衍生-液相色谱法测定水溶肥料中游离氨基酸含量的方法，供相关人员参考。解决方案|液相色谱法测定水溶肥料中游离氨基酸含量 氨基酸水溶肥料，从字面上来看，就是含有氨基酸分子的一类肥料。它是农 业生产中常用的一种多功能、环保型肥料。它将农作物生长过程中的各种营养元 素合理的络合在一起，使用后能提高作物叶绿素含量，增强作物光合作用，能补 充多种营养元素，满足整个作物生长过程中的养分需要。使作物健壮旺盛、根系 发达、叶面浓绿肥厚、坐果率高、果实膨大快、果实丰满、品质好、产量高。并 增强作物抗旱、抗寒、抗病、抗重茬的能力。肥料所含有的有机质、高活性有益 菌群，可以有效抑制土壤中有害菌和病虫害的产生，能活化土壤，增加土壤的 透气性，显著降低生理病害和土壤病害的发生，减少农药使用量，使农产品品质 及产量提高。 氨基酸的含量在氨基酸水溶肥料中尤为重要。农业标准 NY 1429-2010 中 规定了氨基酸有机肥(液体)的含量不低于 100g/L，农业标准《水溶肥料游离 氨基酸含量的测定》 NY/T 1975-2010中对氨基酸的检测方法做了推荐，分别 是氨基酸自动分析仪法和柱前衍生-液相色谱仪法。本文参考NY/T1975-2010，建立了柱前衍生-液相色谱法测定水溶肥料中游离氨基酸含量的方法，供相关人 员参考。 测试原理 试样用磺基水杨酸沉淀蛋白质后，用EDTA络合金属元素释放氨基酸，氨 基酸经化学衍生后由液相色谱仪分离并测定天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯 丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸洪17种氨基酸的含量，这些氨基酸含量综合，几位肥料中游离氨基酸的含量。 仪器和试剂 LC-5510 液相色谱仪(配UV检测器) 实验室常用分析设备； 氨基酸分析方法包； 磺基水杨酸溶液。 实验条件 色谱柱： Amino Acid， 5um， (4.6×250mm))； 流动相： 流动相A： 0.1mol/L醋酸钠溶液(pH6.5)：乙腈=93：7 流动相B：水：乙腈=20：80 流速：1.0 ml/min； 柱温：40℃； 波长：254nm； 进样量：20pL。 梯度程序： 时间 (min) A% B% 0 100 0 11 93 7 13.9 88 12 14 85 15 29 66 34 32 30 70 35 0 100 42 0 100 45 100 0 60 100 0 样品前处理 标准品衍生 分别精称标准品溶液160L， 置于试管中，加入稀释后的A溶液100L和稀 释后的B溶液100以L，摇匀，室温反应 60min；然后加入正己烷溶液400uL，旋紧盖子后振摇 10s，室温下静置分层，去下层200uL溶液，加入800L水 混合均匀，再取200L加入800uL水混合均匀，用孔径为0.22um的有机 滤膜过滤，待分析； 样品前处理 称取适量试样，置于 250mL 容量瓶中，充分溶解后，加水至刻度，混匀。放 置过夜后过滤，取 2mL于 10mL试管中，加入2mL磺基水杨酸溶液，混匀，放置1h。然后准确加入1mLEDTA-Na溶液，混匀，用0.45um 滤膜过滤。将 滤液按照标准样衍生化方法进行衍生，待用。 实验结果 按照下表表格配置氨基酸酸标准溶液，然后进样衍生，按照实验条件调整仪器待 稳定后，将衍生后的标准溶液上机。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标 准曲线。 表1标准溶液浓度 名称 浓度 (mmol/L) 门冬氨酸 0.1 0.2 0.5 1 2.5 谷氨酸 0.1 0.2 0.5 1 2.5 丝氨酸 0.1 0.2 0.5 1 2.5 甘氨酸 0.1 0.2 0.5 1 2.5 组氨酸 0.1 0.2 0.5 1 2.5 精氨酸 0.1 0.2 0.5 1 2.5 苏氨酸 0.1 0.2 0.5 1 2.5 丙氨酸 0.1 0.2 0.5 1 2.5 脯氨酸 0.1 0.2 0.5 1 2.5 酪氨酸 0.1 0.2 0.5 1 2.5 缬氨酸 0.1 0.2 0.5 1 2.5 蛋氨酸 0.1 0.2 0.5 1 2.5 胱氨酸 0.05 0.1 0.25 0.5 1.25 异亮氨酸 0.1 0.2 0.5 1 2.5 亮氨酸 0.1 0.2 0.5 1 2.5 苯丙氨酸 0.1 0.2 0.5 1 2.5 赖氨酸 0.1 0.2 0.5 1 2.5 样品检测 将处理后的样品，按照实验条件进行检测，外标法测定游离氨基酸的含量。 名称 摩尔质量 (g/mol) 原样稀释倍数 检测含量(mM/L) 原样含量 (mM/L) 含量 (g/L) 门冬氨酸 133.1 312.5倍 (取0.8mL定容至 100mL， 取 2mL加前处 理试剂3mL) 0.34 106.25 14.14 谷氨酸 147.13 0.44 137.5 20.23 丝氨酸 105.09 0.56 175 18.39 甘氨酸 75.067 0.39 121.87 9.15 组氨酸 155.15 ND ND ND 精氨酸 174.2 ND ND ND 苏氨酸 119.12 0.21 65.63 7.82 丙氨酸 89.093 0.22 68.75 6.13 脯氨酸 115.13 0.31 96.875 11.15 酪氨酸 181.19 ND ND ND 缬氨酸 117.15 0.19 59.375 6.96 蛋氨酸 149.21 ND ND ND 胱氨酸 240.3 ND ND ND 异亮氨酸 131.17 0.09 28.125 3.69 亮氨酸 131.17 0.01 3.125 0.41 苯丙氨酸 165.19 0.02 6.25 1.03 赖氨酸 146.19 0.08 25 3.65 游离氨基酸总含量 (g/L) 102.75 实验总结 本文参考 NY/T1975-2010，建立了柱前衍生-液相色谱法测定水溶肥料中游离 氨基酸含量的方法。实验表明，改方法样品分离度好，重复性良好，而且结果准 确，可满足标准的需求，供相关人员参考。