利用LUMiSizer®稳定性分析仪系统地研究剪切能的输入与产胞外多糖的嗜热链球菌沉积特性的关系-系列二

利用LUMiSizer®稳定性分析仪系统地研究剪切能的输入与产胞外多糖的嗜热链球菌沉积特性的关系-系列二近年来，能够产生胞外多糖(EPS)的发酵剂的重要性显著增加，例如几种乳酸菌(LAB)。在发酵乳制品中，EPS影响产品粘度和口感。EPS具有较高的水结合能力，对整个体系的粘度影响较大。以分离形式用于食品和制药工业的EPS的例子有右旋糖酐或黄原胶。此外，重要的是要知道，由LAB产生的EPS要么附着在细胞壁上(荚膜EPS)，要么释放到周围的培养基中(游离EPS)。发酵剂的工业生产包括两个主要过程步骤，在特定条件下发酵以及随后从发酵液中分离细菌，这通常是用盘堆离心机完成的。在这里，EPS对发酵液粘度的影响使分离步骤变得困难。另一个复杂的因素是不同的发酵剂通常在同一条生产线上生产，这就是为什么分离条件应该根据各自的菌株进行调整。EPS的特性和类型(游离型、荚膜型或两者都有)对发酵液的粘度有特定的影响，因此对细菌的沉积特性也有特定的影响。经验观察表明，在细胞分离前应用高速剪切均质可改善培养物的沉淀特性，但这种改善也取决于所产生的EPS类型。本研究的目的是系统地研究高速剪切均质步骤对产EPS的乳酸菌菌株分离性能的影响。1. 材料和方法1.1 材料研究了六种不同的嗜热链球菌（ST）菌株，这些菌株在平均细胞链长度和产生荚膜EPS的能力上存在差异(表1)。表1 未剪切嗜热链球菌荚膜EPS产量和平均细胞链长度菌株生成荚膜EPS每个细胞链上的球菌数量ST-C+1-5ST-D-2-19ST-E-1-4ST-G+1-8ST-H+1-6ST-I+1-51.2 剪切处理使用T25高速均质机含有ST发酵培养基进行特定剪切。将30ml样品填充到一个试管中，并在5000、11000、19000或24000 rpm的转速下剪切。在每个搅拌速度下，剪切10 s、20 s、30 s、60 s、120 s后取样。1.3 颗粒沉降速度分析用光学分析离心机(LUMiSizer, LUM GmbH, Berlin, Germany)测量未剪切和剪切样品的沉降速度分布。将稀释样品(与生理氯化钠溶液的比例为1:2)填充到每个样品管中，使用3600 rpm进行测试。采用恒定位置法，在靠近样品管底部的三个径向位置(123、125和127毫米) 用SEPView程序计算沉降速度分布。1.4 沉积物压缩行为分析使用LUMiSizer测量样品的沉积物压缩。样品管中加入未稀释的样品，LUMiSizer的速度以500 rpm为步阶在1500 rpm和4000 rpm之间变化。2. 结果与分析2. 能量输入强度对颗粒沉降速度的影响图4  剪切能对荚膜EPS产生器ST-C沉降速度分布的影响。黑色为未剪切基准，剪切速度设置为5000rpm(灰色虚线)、11000 rpm(灰色实线)、19000 rpm(浅灰色虚线)、 24000 rpm(浅灰色实线) ，所有样品的剪切持续时间为120s。图4显示了未剪切的ST-C和在不同UT速度下剪切120秒的ST-C的沉降速度分布。很明显，细胞链在剪切120秒后几乎完全断裂，而与所施加的剪切速度无关。关于最大峰值高度的位置，发现能量输入强度和总能量输入越大，沉降速度越快。图5 在相似能量输入(上图，12.5 J/ml;下图，1050 J/ml)下，比较了不同剪切强度对ST-C(黑色)和ST-D(灰色)的沉降速度分布产生的影响。在相同的能量输入下，实线表示较高的剪切强度 (较高的UT速度)，虚线表示剪切强度较低(延长剪切时长)。图5显示了ST-C和ST-D在不同剪切速度、不同剪切时间、但输入能量相似的情况下的沉降速度分布。以11000转/分钟的转速剪切10秒或以5000转/分钟的转速剪切60秒，可获得12.5 J/ml的能量输入。在能量输入为1050 J/ml时，高剪切强度和低剪切强度对应的值分别为24000 rpm持续60秒或19000 rpm持续120秒。在相似的能量输入下，沉降速度分布明显取决于获得该能量的方式。ST-C在12.5 J/ml时，剪切速度越快，剪切时长越短，沉降速度越快，分布范围越广。这表明，在较高的剪切速度下，荚膜EPS被更有效地剪切，而大多数细胞链未受影响。对ST-D也观察到类似的影响，表明剪切强度越高，细胞链断裂越低。在190J/ml的能量输入下获得的数据证实了这一点（数据未显示）。然而，当能量输入为1050 J/ml时，剪切强度对沉降分布影响不大。单峰表明所有细胞链都已被破坏。这意味着当以高强度短时间剪切时，产生荚膜EPS和游离EPS的菌株均断裂为较小的细胞链，因此平均沉降速度较高。2.4 沉积物压缩图6 剪切处理对ST-C沉积动力学的影响。剪切速度为19,000 rpm，剪切时长0秒(实线)、10秒(长虚线)、30秒(短虚线)或120秒(虚线)。研究了剪切处理对不同菌株细胞沉积物的影响。图6展示了ST-C在19,000rpm下不同剪切时长的沉积动力学。坡度的急弯反映了从沉积（高坡度）到沉积物压缩（低坡度）的过渡。在沉降后的所有曲线中可以看到的倾斜度表明，无论之前的剪切过程如何，沉积物都是可压缩的。很明显，随着剪切处理时间的延长，过渡点提前到达。压缩前的沉积物高度降低（(径向位置越高，泥沙高度越低）。这也意味着，在沉积物压缩开始之前，较高的剪切处理导致更快的沉降和更明显的分离。未剪切样品的沉降动力学表明，颗粒之间存在一些相互作用（例如相互摩擦或相互粘滞），而这些相互作用通过剪切而减弱。由于剪切作用导致沉积速度加快，但也导致沉积物更加致密，因此荚膜EPS层的剪切作用可能是颗粒之间相互依赖性改变的原因。两者都是生产发酵剂所需的。对产生游离EPS的菌株ST-D观察到类似但较弱的效果（数据未显示）。这里，沉积物密实度的增加可以归因于细胞链的破坏，并且由于粘度的降低，沉积速度更快。只有产生游离EPS的菌株ST-E没有显示沉积物压缩，并且在沉积物高度方面不受剪切影响（数据未显示）。然而，与ST-D相似，介质粘度降低导致沉降速度加快。因此，最终沉积物高度提前达到。图7 剪切处理和相对离心力对荚膜EPS产生菌株沉积物厚度的影响。剪切速度为19,000 rpm，剪切时长为0 s(菱形)、10 s(正方形)、30 s(三角形)、120 s(圆形)。图7为剪切和RCA（相对离心加速度）对荚膜EPS产生菌株(ST-I)沉积高度的影响示例。随着RCA的增加，由于作用在沉积物上的力增加，沉积物高度呈对数下降。这表明该应变的沉积物是可压缩的。随着剪切力的增加，沉积物高度也降低，因此剪切导致沉积物更加致密。这种效应是剪切荚膜EPS的结果。这降低了颗粒之间的相互依赖性，并导致沉积物更加致密。这种行为对于ST-C也可见，并且对于长细胞链和产生游离EPS的ST-D也可见。另一种产生游离EPS的ST-E菌株在沉积物高度上没有显著变化，因此剪切和增加rcf都没有对其产生影响。3. 结论本研究表明，剪切可以影响发酵培养基中细菌细胞的沉降速度。结果表明:(a)剪切荚膜EPS对沉积速度的影响最大;(b)对于只产生游离EPS的菌株，剪切降低了发酵液表观粘度，从而提高了沉淀速度;(c)长细胞链的破坏导致颗粒尺寸变小，从而导致沉降速度降低。平均沉降速度的比较揭示了这三种影响的组合。由于粘度的变化导致较高的沉降速度，使沉积物形成速度加快，但对沉积物压缩没有影响。细胞链的破坏降低了沉积速度，但由于颗粒尺寸的减小，导致沉积物更加致密。由于剪切作用发酵剂表面的荚膜EPS减少，从而降低了颗粒之间的相互依赖性，因此，导致沉积物的强烈压实，这可能有助于发酵剂生产过程中细胞的分离。利用 LUMiSizerQ稳定性分析仪系统地研究剪切能的输入与产胞外多糖的嗜热链球菌沉积 特性的关系-系列二 近年来，能够产生胞外多糖(EPS)的发酵剂的重要性显著增加，例如几种乳酸菌(LAB)。在发 酵乳制品中， EPS 影响产品粘度和口感。EPS 具有较高的水结合能力，对整个体系的粘度影 响较大。以分离形式用于食品和制药工业的 EPS 的例子有右旋糖酐或黄原胶。此外，重要的 是要知道，由 LAB产生的 EPS 要么附着在细胞壁上(荚膜 EPS)， 要么释放到周围的培养基中 (游离EPS)。 发酵剂的工业生产包括两个主要过程步骤，在特定条件下发酵以及随后从发酵液中分离细 菌，这通常是用盘堆离心机完成的。在这里， EPS 对发酵液粘度的影响使分离步骤变得困难。另 一 个复杂的因素是不同的发酵剂通常在同一条生产线上生产，这就是为什么分离条件应该 根据各自的菌株进行调整。EPS的特性和类型(游离型、荚膜型或两者都有)对发酵液的粘度 有特定的影响，因此对细菌的沉积特性也有特定的影响。经验观察表明，在细胞分离前应用 高速剪切均质可改善培养物的沉淀特性，但这种改善也取决于所产生的 EPS类型。 本研究的目的是系统地研究高速剪切均质步骤对产 EPS 的乳酸菌菌株分离性能的影响。 1.材料和方法 1.1材料 研究了六种不同的嗜热链球菌(ST)菌株，这些菌株在平均细胞链长度和产生荚膜 EPS 的能 力上存在差异(表1)。 表1未剪切嗜热链球菌荚膜 EPS 产量和平均细胞链长度 菌株 生成荚膜 EPS 每个细胞链上的球菌数量 ST-C 十 1-5 ST-D 2-19 ST-E 1-4 ST-G 十 1-8 ST-H 十 1-6 ST-T 十 1-5 1.2剪切处理 使用 T25高速均质机含有 ST 发酵培养基进行特定剪切。将 30ml样品填充到一个试管中，并 在5000、11000、19000或24000 rpm 的转速下剪切。在每个搅拌速度下，剪切 10 s、20 s、30 s、60 s、120 s 后取样。 1.3颗粒沉降速度分析 用光学分析离心机(LUMiSizer，LUM GmbH， Berlin，Germany)测量未剪切和剪切样品的沉 降速度分布。将稀释样品(与 生理氯化钠溶液的比例为1：2)填充到每个样品管中，使用3600rpm 进行测试。采用恒定位置法，在靠近样品管底部的三个径向位置(123、125和127毫 米)用 SEPView 程序计算沉降速度分布。 1.4沉积物压缩行为分析 使用 LUMiSizer 测量样品的沉积物压缩。样品管中加入未稀释的样品，LUMiSizer 的速度以 500 rpm 为步阶在1500 rpm 和4000 rpm 之间变化。 结果与分析 22能量输入强度对颗粒沉降速度的影响 sedimentation velocity [um/s] 图4 剪切能对荚膜 EPS 产生器 ST -C 沉降速度分布的影响。黑色为未剪切基准，剪切速度设置为 5000rpm(灰色虚线)、11000 rpm(灰色实线)、19000 rpm(浅灰色虚线)、、24000 rpm(浅灰色实线)，所 有 样品的剪切持续时间为120s 。 图4显示了未剪切的 ST-C 和在不同 UT速度下剪切120秒的ST-C的沉降速度分布。很明显，细胞链在剪切120秒后几乎完全断裂，而与所施加的剪切速度无关。关于最大峰值高度的位 置，发现能量输入强度和总能量输入越大，沉降速度越快。 sedimentation velocity [um/s] 图5在相似能 量 输入(上图，12.5 J /ml；下图，1050 J /ml)下 ， 比较了不同剪切强度对 ST -C(黑色)和 ST -D(灰色)的沉降速度分布产生的影响 。在相同的能 量 输入下，实线表 示 较 高 的剪切强度(较 高 的 U T 速 度)，虚线表示 剪 切强度较低(延长剪切时长)。 图5显示了 ST-C 和 ST-D在不同剪切速度、不同剪切时间、但输入能量相似的情况下的沉降 速度分布。以11000转/分钟的转速剪切10秒或以5000转/分钟的转速剪切60秒，，可获得 12.5 J/ml 的能量输入。在能量输入为 1050 J/ml时，高剪切强度和低剪切强度对应的值分 别为24000 rpm 持续60秒或19000 rpm 持续120秒。在相似的能量输入下，沉降速度分布 明显取决于获得该能量的方式。ST-C在12.5J/ml时，剪切速度越快，剪切时长越短，沉 降速度越快，分布范围越广。这表明，在较高的剪切速度下，荚膜 EPS被更有效地剪切，而 大多数细胞链未受影响。对 ST-D 也观察到类似的影响，表明剪切强度越高，细胞链断裂越 低。在 190J/ml 的能量输入下获得的数据证实了这一点(数据未显示)。然而，，当能量输入 为1050 J/ml时， 剪切强度对沉降分布影响不大。单峰表明所有细胞链都已被破坏。这意味 着当以高强度短时间剪切时，产生荚膜 EPS 和游离 EPS 的菌株均断裂为较小的细胞链，因此 平均沉降速度较高。 2.4沉积物压缩 图6剪切处理对 ST-C 沉积动力学的影响。剪切速度为19，000 rpm， 剪切时长0秒(实线)、10秒(长虚 线)、30秒(短 虚线)或120秒(虚线)。 研究了剪切处理对不同菌株细胞沉积物的影响。图6展示了 ST-C 在 19，000rpm 下不同剪切 时长的沉积动力学。坡度的急弯反映了从沉积(高坡度)到沉积物压缩(低坡度)的过渡。在沉降后的所有曲线中可以看到的倾斜度表明，无论之前的剪切过程如何，沉积物都是可压 缩的。很明显，随着剪切处理时间的延长，过渡点提前到达。压缩前的沉积物高度降低((径 向位置越高，泥沙高度越低)。这也意味着，在沉积物压缩开始之前，较高的剪切处理导致 更快的沉降和更明显的分离。未剪切样品的沉降动力学表明，颗粒之间存在一些相互作用 (例如相互摩擦或相互粘滞)，而这些相互作用通过剪切而减弱。由于剪切作用导致沉积速 度加快，但也导致沉积物更加致密，因此荚膜 EPS 层的剪切作用可能是颗粒之间相互依赖性 改变的原因。两者都是生产发酵剂所需的。对产生游离 EPS 的菌株 ST -D观察到类似但较弱 的效果(数据未显示)。这里，沉积物密实度的增加可以归因于细胞链的破坏，并且由于粘 度的降低，沉积速度更快。只有产生游离 EPS 的菌株 ST -E 没有显示沉积物压缩，并且在沉 积物高度方面不受剪切影响(数据未显示)。然而，与 ST-D 相似，介质粘度降低导致沉降速 度加快。因此，最终沉积物高度提前达到。 图 7剪 切处理和相对离心力对荚膜 EPS 产 生菌株沉积物厚度 的 影响。剪切速度为 19，000 r pm， 剪切时长 为0s(菱形)、10 s(正方 形 )、30s(三 角形)、120s(圆形)。 图7为剪切和 RCA(相对离心加速度)对荚膜 EPS 产生菌株(ST-I)沉积高度的影响示例。随 着 RCA 的增加，由于作用在沉积物上的力增加，沉积物高度呈对数下降。这表明该应变的沉 积物是可压缩的。随着剪切力的增加，沉积物高度也降低，因此剪切导致沉积物更加致密。这种效应是剪切荚膜 EPS 的结果。这降低了颗粒之间的相互依赖性，并导致沉积物更加致 密。这种行为对于 ST -C 也可见，并且对于长细胞链和产生游离 EPS 的 ST -D 也可见。另 一 种 产生游离 EPS 的 ST-E 菌株在沉积物高度上没有显著变化，因此剪切和增加 rcf 都没有对其 产生影响。 3.结论 本研究表明，剪切可以影响发酵培养基中细菌细胞的沉降速度。结果表明：(a)剪切荚膜EPS 对沉积速度的影响最大；(b)对于只产生游离 EPS 的菌株，剪切降低了发酵液表观粘度，从而 提高了沉淀速度；(c)长细胞链的破坏导致颗粒尺寸变小，从而导致沉降速度降低。平均沉降 速度的比较揭示了这 三 种影响的组合。由于粘度的变化导致较高的沉降速度，使沉积物形成 速度加快，但对沉积物压缩没有影响。细胞链的破坏降低了沉积速度，但由于颗粒尺寸的减 小，导致沉积物更加致密。由于剪切作用发酵剂表面的荚膜 EPS减少，从而降低了颗粒之间 的相互依赖性，因此，导致沉积物的强烈压实，这可能有助于发酵剂生产过程中细胞的分离。