生活饮用水中粪大肠菌群检测方案(大肠杆菌测定)

　酶底物法（Defined Substrate Technology,DST）是指在选择性培养基上能产生β-半乳糖苷酶，（β-D-galactosidase）的细菌群组能分解色原底物释放出色原体是培养基呈颜色变化，以此技术来检测水中大肠菌群的方法。该方法在全球广泛的被使用在检测水中粪大肠杆菌及总大肠菌群。立科固定没酶底物法产品经过多年研发，全球使用广泛的测试方法，中华人名共和国国家标准检测方法，被国内多家供水公司、疾病预防控制中心、环境检测中心及水文站全面使用。本文采用立科酶底物法检测大肠菌群，结果表明该方法的特异性强，时间周期短，数据准确，二次污染小、简便快速，适用推广应用。1、立科酶底物法简介Colitech酶底物法试剂采用GB/T5750.12-2006中固定底物技术（Defined Subsrate Technology,DST）的Minimal Medium ONPG-MUG(MMO-MUG)培养基，当Colitech酶底物法检测试剂加入含有总大肠菌群细菌组的水样，目标细菌在含有固定底物ONPG-MUG的培养基中繁殖，大肠菌群细菌组产生的特异性生物酶β-半乳糖苷酶能分解Minimal Medium ONPG-MUG培养基中的固定色原底物ONPG，使培养基呈现黄色反应，同时水样中大肠埃希氏菌产生特异性B-葡萄糖苷酸酶分解Minimal Medium ONPG-MUG培养基中的固定荧光底物MUG，产生特征性蓝色荧光。因而可以定性检测水中大肠菌群和大肠埃希氏菌。当水样中少数非目标细菌的生物酶试图和OPNG或MUG，产生特征性蓝色荧光。因而可以定性检测水中大肠菌群和大肠埃希氏菌。当水样中少数非目标细菌的生物酶试图和ONPG或MUG反应，干扰检测结果时，colitech培养基中特殊配方的基质会抑制其反应过程，控制假阳性的产生；同时，这些特殊培养基质可以有效促使目标细菌的生物酶和固定底物反应，所以假阴性发生率比传统方法更低。Colitech酶底物法检测试剂为符合《生活饮用水标准检测方法》的培养基。Colitech和51或97孔定量检测盘联合使用，可以定量检测100毫升水样中0~200个或0~2419个目标细菌，而不要稀释。 2、酶底物法仪器与试剂仪器培养箱（36±1℃），高压蒸汽灭菌器，定量盘（51孔和91孔），程控定量封口机，试管，稀释瓶，移液管，量筒。试剂立科colitech酶底物法检测试剂，灭菌稀释水。 3、酶底物法检测步骤3.1水样稀释检测所需水样为100ml。若水样污染严重时可进行稀释，取10ml水样加入到90ml灭菌稀释水中，必要时要加大稀释度。本实验室取20个水样分别进行总大肠菌群（1-10）和粪大肠菌群（11-20）检测。3.2定性试验用100ml的无菌稀释瓶量取100ml水样，加入立科培养基，摇晃至溶解，36±1℃培养24小时。3.3定量试验用100ml的无菌稀释瓶量取100ml水样，加入立科培养基，摇床至溶解，将该溶液导入51孔（总大肠菌群）或97孔（粪大肠菌群）定量盘内，将定量盘放入程控定量封口机封口，36±1℃培养24小时。结果报告定性反应将水样培养24h后进行结果判读，如颜色变成黄色，判断为阳性反应，表示水中含有大肠菌群，若水样未发生颜色变化，判断为阴性反应，表示水样中不含大肠菌群。定性结果以大肠菌群检出货未检出报告。结果见表1。 表1定性反应结果 水样编号 反应结果 水样编号 水源水样 1 ＋ 11 ＋ 2 ＋ 12 ＋ 3 － 13 ＋ 4 － 14 － 5 ＋ 15 ＋ 6 － 16 ＋ 7 － 17 － 8 ＋ 18 ＋ 9 ＋ 19 ＋ 10 ＋ 20 ＋   定量反应将培养24h的定量盘内水样进行结果判读，如果孔穴内的水样变成黄色则表示该孔穴中含有大肠菌群，几乎有黄色反应的孔穴数，总大肠菌群对照51孔定量盘法不同阳性结果的可能数（MPN）及95%可信范围表，粪大肠菌群对照97孔定量盘法不同阳性结果的MPN值查出其代表的大肠菌群可能数（MPN），结果以MPN/L报告，如果所有孔均未产生黄色，以未检出报告。结果见表2.3。 表2总大肠菌群定量反应结果（51孔） 水样编号 阳性孔数 MPN/L 1 6 64 2 15 178 3 0 ＜10 4 0 ＜10 5 3 21 6 0 ＜10 7 0 ＜10 8 1 10 9 22 288 10 16 192    表3粪大肠菌群定量反应结果（97孔） 水样编号 阳性孔数（大孔） 阳性孔数（小孔） 稀释倍数 MPN/L 1 38 21 100 1.17×103 2 25 16 100 5.73×104 3 19 14 50 8.32×103 4 0 0 - ＜10 5 36 20 1000 1.03×105 6 19 2 1000 2.43×105 7 0 0 - ＜10 8 49 26 1000 4.88×106 9 48 28 10000 3.97×107 10 42 25 - 1.64×103   结语本实验采用酶底物法检测水样中大肠菌群，无需制备培养基，只需独立包装立科培养基溶解后，即可使用。检测每个样品只需简单5步即可，操作简单，快捷，实际手工操作的时间只需两分钟，无需在无菌室内操作，结果准确减少假阳性反应与假阴性反应，判读容易，满足GB5749-2006生活饮用水标准和GB8978-1996污水综合排放标准。可应用于源水，瓶装水，饮用水，畜牧用水，废水，再生水，食品水，医疗用水等各样水样，可以很好的用于突发事件应急。