SepaFlash 氨基柱对糖类化合物的制备纯化研究 背景介绍 糖类化合物亦称碳水化合物,是多羟基(2个以上)的醛类或酮类化合物,在水解后能变成以上两者之一的有机化合物,在化学上由于其碳、氢、氧元素构成,在化学式的表现上类似于“碳”与“水”的聚合,故又称碳水化合物。糖类主要分为单糖、多糖、低聚糖。所有的糖都是以单糖为基本单位构成,从单糖开始,如葡萄糖和果糖,可以形成双糖、三糖或四糖,甚至有上亿个糖分子组成的复合聚合物--多糖。 糖类化合物是植物、动物和微生物的重要组分,与人类生活密切相关,是人体能量的主要来源。它不仅是营养物质,而且有些还具有特殊的生理活性。当其与脂质、肽、蛋白质甚至核酸结合时在医学上有相当大的应用,例如:人需要葡萄糖注射液、右旋糖酐作血浆制剂,肝脏中的肝素有抗凝血作用,血型中的糖与免疫活性有关。此外,核酸的组成成分中也含有糖类化合物--核糖和脱氧核糖。糖类化合物在医学、营养学、免疫学等方面的应用日益受到越来越多研究人员的重视。 糖类化合物缺乏发色基团,导致其无紫外吸收或紫外吸收很弱,传统快速液相色谱法通常只配备紫外 (UV)检测器,不能检测低含量或缺乏发色团的目标化合物。而低温蒸发光散射检测器 (ELSD) 作为一一种近乎通用的技术,具有紫 外检测器不可比拟的优越性,任何挥发性低于流动相的样品均能被检测,此外ELSD 的检测灵敏度也较高,,可检测到更多微弱的信号。 本研究探讨使用 SepaBean machine 快速液相制备色谱系统检测技术对糖类化合物进行制备纯化,结合 UV 检测器和 ELSD 检测器(蒸发光散射检测器)共同检测。选取葡萄糖、果糖、乳糖三种样品,由于样品为极性很强强糖类分子,在普通C18反相柱上保留很弱,针对样品的具体性质,应用工程师利用 Sepa Flash氨基柱配合快速液相制备色谱系统 SepaBean machine 并与 ELSD 检测器联用,成功对样品进行了纯化,为极性很强的糖类化合物的制备纯化提供了一种可行的方案。 实验部分 样品信息: 葡萄糖: Glucose,C6H12O6,葡萄糖在生物学领域具有重要地位,是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物,即生物的主要供能物质。 果糖: Fructose, C6H12O6,广泛应用于食品、医药、保健品生产中。 乳糖: Lactose, C12H22O11,乳糖主要用于制造婴儿食品和配制药物,例如制药片、药粉时用作稀释剂。 以上样品极性很大,易溶于水,其分子结构式示意图参见图1。 图1.糖类样品分子结构式示意图 由于样品分子极性很大,易溶于水而在有机溶剂中溶解度很低,因此正相分离模式首先被排除。在反相分离模式中, C18反相分离柱是常用的一种通用分离柱,适合各类极性较大样品的分离,因此我们首先尝试用一根 C18反相分离柱对样品进行制备纯化。称取2g葡萄糖,2g果糖,94g乳糖样品溶于50ml水中, 利用注射器取1ml 混合样品上样至 Flash 分离柱上。相同的上样量条件下,我们也尝试用氨基柱进行实验,相较于 C18 反相分离柱,氨基分离柱适用于极性更大的样品纯化,样品的 Flash制备纯化实验参数如表1所示。 表1.]Flash 制备纯化实验参数设置 仪器 SepaBean machine T 色谱柱 25g SepaFlash C18 反相分离柱(超纯无定形C18硅胶,40-63um,100 A,订货号: SW-8201-025-IR) 25 g SepaFlash 氨基分离柱(超纯无定形 NH2 键合硅胶,40-63 um, 60A, 订货号:SW-5501-025-IR) 检测波长 254nm, 280nm,,ELSD 流动相 溶剂A:水,溶剂B:乙腈 流速 30 mL/min 进样量 1ml 洗脱梯度 时间 (Time) 溶剂 B(%) 时间 (Time) 溶剂B (%) 0 95 0 95 30 70 30 70 40 70 40 70 ELSD 检测器参数设定 ELSD 流速 1ml/min 增益值 0 ELSD 温度 60℃ 滤波常数 4s 气压 2.2bar 结果与讨论 样品在普通 C18反相柱上的 Flash 制备图谱如图2所示。分析图2可知,由于样品极性较大,样品在普通 C18反相柱上基本没有保留,随着流动相直接从分离柱上被洗脱下来,未能获得有效的纯化。此外,从 Flash 制备图谱也可以看出,样品在紫外波段没有吸收信号,必须利用外接的 ELSD 检测器才能检测样品的信号。 图2.样品在C18分离柱上的 Flash 制备纯化图谱 实验结果显示普通 C18反相柱对物质保留较弱,这就是常用的反相模式的短板。众所周知,亲水相互作用色谱(hydrophilic interaction chromatography,HILIC) 采用强亲水性的极性固定相,适合于极性较大的样品的分离纯化。因此后考虑采用 HILIC 模式对样品进行制备纯化,如三泰科技推出的 SepaFlash 氨基分离柱,其填料表面键合有极性很强的氨基基团(参见图3),可以对亲水性化合物样品产生足够的保留作用。 图3. SepaFlash氨基柱固定相键合基团示意图 HILIC 色谱分离模式,与传统正相色谱相似,固定相比流动相具有更强的亲水性,极性物质倾向于与固定相作用,从而增加保留。然后逐渐增加流动相的极性而使样品依次洗脱。但其所用的溶剂又与反相色谱相似,采用与水互溶的极性有机溶剂(一般为乙腈); 而不用传统正相色谱中所用溶剂(如正己烷、三氯甲烷)。通常以高浓度极性有机溶剂和低浓度水溶液为流动相,其中有机部分是弱溶剂,水溶液是强溶剂。水相比例在洗脱过程中逐步提高,因此适合于极性较大的样品的分离纯化。 利用 SepaFlash 氨基分离柱对样品制备纯化图谱如图4所示。样品在氨基分离柱上获得了有效的保留,三个样品分离度良好,成功对糖类化合物进行了制备纯化。 图4.样品在氨基分离柱上的 Flash制备纯化图谱 氨基柱的键合官能团氨丙基比反相色谱中常用的C18、C8等官能团更容易水解,因此当氨基柱在反相模式下使用时,其使用寿命会稍逊于普通的 C18柱。需要特别注意控制所使用的流动相,流动相 PH 值越低或者含水比例越高造成氨基柱键合相水解的危险就越大。HILIC 模式下,流动相选择时,首先确保流动相中至少含有3~5%的极性溶剂(如5%水,5%甲醇),以保证氨基柱中的硅胶始终处于被水浸润的状态;其次流动相体系中至少含有50%的有机相(一般情况下,有机相比例尽量不低于70%)。氨基柱使用结束后,为保证其使用寿命,以95%乙腈/5%水作为氨基柱的保存溶剂。若需长期保存不用时,需将氨基柱用异丙醇保存起来。 SepaFlash 氨基柱订购信息 三泰科技推出的 SepaFlash 氨基柱系列产品具有多种规格(参见表2)。 表 2. SepaFlash氨基柱参数 (Ultra-pure irregular NH2, 40 -63 um, 60 A, amino content: 1.3 mmol/g, end-capped,surface area: 500m2/g, loading capacity: 0.1-2%) Item Number Column Size Flow Rate Max.Pressure (mL/min) (psi/bar) SW-5501-004-IR 5.9g 10-20 400/27.5 SW-5501-012-IR 23g 15-30 400/27.5 SW-5501-025-IR 38g 15-30 400/27.5 SW-5501-040-IR 55g 20-40 400/27.5 SW-5501-080-IR 122g 30-60 350/24.0 SW-5501-120-IR 180g 40-80 300/20.7 SW-5501-220-IR 340g 50-100 300/20.7 SW-5501-330-IR 475g 50-100 250/17.2 SepaFlash氨基柱对糖类化合物的制备纯化研究 背景介绍糖类化合物亦称碳水化合物,是多羟基(2个以上)的醛类或酮类化合物,在水解后能变成以上两者之一的有机化合物,在化学上由于其碳、氢、氧元素构成,在化学式的表现上类似于“碳”与“水”的聚合,故又称碳水化合物。糖类主要分为单糖、多糖、低聚糖。所有的糖都是以单糖为基本单位构成,从单糖开始,如葡萄糖和果糖,可以形成双糖、三糖或四糖,甚至有上亿个糖分子组成的复合聚合物--多糖。糖类化合物是植物、动物和微生物的重要组分,与人类生活密切相关,是人体能量的主要来源。它不仅是营养物质,而且有些还具有特殊的生理活性。当其与脂质、肽、蛋白质甚至核酸结合时在医学上有相当大的应用,例如:人需要葡萄糖注射液、右旋糖酐作血浆制剂,肝脏中的肝素有抗凝血作用,血型中的糖与免疫活性有关。此外,核酸的组成成分中也含有糖类化合物--核糖和脱氧核糖。 糖类化合物在医学、营养学、免疫学等方面的应用日益受到越来越多研究人员的重视。糖类化合物缺乏发色基团,导致其无紫外吸收或紫外吸收很弱,传统快速液相色谱法通常只配备紫外 (UV) 检测器,不能检测低含量或缺乏发色团的目标化合物。而低温蒸发光散射检测器(ELSD)作为一种近乎通用的技术,具有紫外检测器不可比拟的优越性,任何挥发性低于流动相的样品均能被检测,此外ELSD的检测灵敏度也较高,可检测到更多微弱的信号。本研究探讨使用SepaBean machine快速液相制备色谱系统检测技术对糖类化合物进行制备纯化,结合UV检测器和ELSD检测器(蒸发光散射检测器)共同检测。选取葡萄糖、果糖、乳糖三种样品,由于样品为极性很强的糖类分子,在普通C18反相柱上保留很弱,针对样品的具体性质,应用工程师利用Sepa Flash氨基柱配合快速液相制备色谱系统SepaBean machine并与ELSD检测器联用,成功对样品进行了纯化,为极性很强的糖类化合物的制备纯化提供了一种可行的方案。实验部分样品信息:葡萄糖:Glucose,C6H12O6,葡萄糖在生物学领域具有重要地位,是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物,即生物的主要供能物质。果糖:Fructose,C6H12O6,广泛应用于食品、医药、保健品生产中。乳糖:Lactose,C12H22O11,乳糖主要用于制造婴儿食品和配制药物,例如制药片、药粉时用作稀释剂。以上样品极性很大,易溶于水,其分子结构式示意图参见图1。 图1. 糖类样品分子结构式示意图由于样品分子极性很大,易溶于水而在有机溶剂中溶解度很低,因此正相分离模式首先被排除。在反相分离模式中,C18反相分离柱是常用的一种通用分离柱,适合各类极性较大样品的分离,因此我们首先尝试用一根C18反相分离柱对样品进行制备纯化。称取2g葡萄糖,2g果糖,4g乳糖样品溶于50ml水中,利用注射器取1ml混合样品上样至Flash分离柱上。相同的上样量条件下,我们也尝试用氨基柱进行实验,相较于C18反相分离柱,氨基分离柱适用于极性更大的样品纯化,样品的Flash制备纯化实验参数如表1所示。表1. Flash制备纯化实验参数设置仪器SepaBean machine T色谱柱25g SepaFlash C18反相分离柱(超纯无定形C18硅胶, 40 - 63 μm,100 Å,订货号:SW-8201-025-IR)25 g SepaFlash氨基分离柱 (超纯无定形NH2键合硅胶, 40 - 63 μm,60 Å,订货号:SW-5501-025-IR)检测波长254 nm,280 nm, ELSD流动相溶剂A:水,溶剂B:乙腈流速30 mL/min进样量1ml洗脱梯度时间 (Time)溶剂B (%)时间 (Time)溶剂B (%)0950953070307040704070ELSD检测器参数设定ELSD流速1ml/min增益值0ELSD温度60℃滤波常数4s气压2.2bar结果与讨论样品在普通C18反相柱上的Flash制备图谱如图2所示。分析图2可知,由于样品极性较大,样品在普通C18反相柱上基本没有保留,随着流动相直接从分离柱上被洗脱下来,未能获得有效的纯化。此外,从Flash制备图谱也可以看出,样品在紫外波段没有吸收信号,必须利用外接的ELSD检测器才能检测样品的信号。图2. 样品在C18分离柱上的Flash制备纯化图谱实验结果显示普通C18反相柱对物质保留较弱,这就是常用的反相模式的短板。众所周知,亲水相互作用色谱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)采用强亲水性的极性固定相,适合于极性较大的样品的分离纯化。因此后考虑采用HILIC模式对样品进行制备纯化,如三泰科技推出的SepaFlash 氨基分离柱,其填料表面键合有极性很强的氨基基团(参见图3),可以对亲水性化合物样品产生足够的保留作用。 图3. SepaFlash氨基柱固定相键合基团示意图 HILIC色谱分离模式,与传统正相色谱相似,固定相比流动相具有更强的亲水性,极性物质倾向于与固定相作用,从而增加保留。然后逐渐增加流动相的极性而使样品依次洗脱。但其所用的溶剂又与反相色谱相似,采用与水互溶的极性有机溶剂 (一般为乙腈); 而不用传统正相色谱中所用溶剂(如正己烷、三氯甲烷) 。通常以高浓度极性有机溶剂和低浓度水溶液为流动相,其中有机部分是弱溶剂, 水溶液是强溶剂。水相比例在洗脱过程中逐步提高,因此适合于极性较大的样品的分离纯化。利用SepaFlash氨基分离柱对样品制备纯化图谱如图4所示。样品在氨基分离柱上获得了有效的保留,三个样品分离度良好,成功对糖类化合物进行了制备纯化。图4. 样品在氨基分离柱上的Flash制备纯化图谱氨基柱的键合官能团氨丙基比反相色谱中常用的C18、C8等官能团更容易水解,因此当氨基柱在反相模式下使用时,其使用寿命会稍逊于普通的C18柱。需要特别注意控制所使用的流动相,流动相PH值越低或者含水比例越高造成氨基柱键合相水解的危险就越大。HILIC模式下,流动相选择时,首先确保流动相中至少含有3~5%的极性溶剂(如5%水,5%甲醇),以保证氨基柱中的硅胶始终处于被水浸润的状态;其次流动相体系中至少含有50%的有机相(一般情况下,有机相比例尽量不低于 70%)。氨基柱使用结束后,为保证其使用寿命,以95%乙腈/5%水作为氨基柱的保存溶剂。若需长期保存不用时,需将氨基柱用异丙醇保存起来。 SepaFlash 氨基柱订购信息三泰科技推出的SepaFlash 氨基柱系列产品具有多种规格(参见表2)。表2. SepaFlash 氨基柱参数(Ultra-pure irregular NH2, 40 – 63 μm, 60 Å, amino content: 1.3 mmol/g, end-capped, surface area: 500m2/g, loading capacity: 0.1-2%)Item NumberColumn SizeFlow Rate(mL/min)Max.Pressure(psi/bar)SW-5501-004-IR5.9 g10-20400/27.5SW-5501-012-IR23 g15-30400/27.5SW-5501-025-IR38 g15-30400/27.5SW-5501-040-IR55 g20-40400/27.5SW-5501-080-IR122 g30-60350/24.0SW-5501-120-IR180 g40-80300/20.7SW-5501-220-IR340 g50-100300/20.7SW-5501-330-IR475 g50-100250/17.2 如需进一步了解SepaBean machine的详细规格信息,或配套使用的Flash纯化柱订购信息,请访问ChemBeanGo在线商店