糖类化合物中制备纯化检测方案(制备液相色谱)

SepaFlash 氨基柱对糖类化合物的制备纯化研究 背景介绍 糖类化合物亦称碳水化合物，是多羟基(2个以上)的醛类或酮类化合物，在水解后能变成以上两者之一的有机化合物，在化学上由于其碳、氢、氧元素构成，在化学式的表现上类似于“碳”与“水”的聚合，故又称碳水化合物。糖类主要分为单糖、多糖、低聚糖。所有的糖都是以单糖为基本单位构成，从单糖开始，如葡萄糖和果糖，可以形成双糖、三糖或四糖，甚至有上亿个糖分子组成的复合聚合物--多糖。 糖类化合物是植物、动物和微生物的重要组分，与人类生活密切相关，是人体能量的主要来源。它不仅是营养物质，而且有些还具有特殊的生理活性。当其与脂质、肽、蛋白质甚至核酸结合时在医学上有相当大的应用，例如：人需要葡萄糖注射液、右旋糖酐作血浆制剂，肝脏中的肝素有抗凝血作用，血型中的糖与免疫活性有关。此外，核酸的组成成分中也含有糖类化合物--核糖和脱氧核糖。糖类化合物在医学、营养学、免疫学等方面的应用日益受到越来越多研究人员的重视。 糖类化合物缺乏发色基团，导致其无紫外吸收或紫外吸收很弱，传统快速液相色谱法通常只配备紫外 (UV)检测器，不能检测低含量或缺乏发色团的目标化合物。而低温蒸发光散射检测器 (ELSD) 作为一一种近乎通用的技术，具有紫 外检测器不可比拟的优越性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，此外ELSD 的检测灵敏度也较高，，可检测到更多微弱的信号。 本研究探讨使用 SepaBean machine 快速液相制备色谱系统检测技术对糖类化合物进行制备纯化，结合 UV 检测器和 ELSD 检测器(蒸发光散射检测器)共同检测。选取葡萄糖、果糖、乳糖三种样品，由于样品为极性很强强糖类分子，在普通C18反相柱上保留很弱，针对样品的具体性质，应用工程师利用 Sepa Flash氨基柱配合快速液相制备色谱系统 SepaBean machine 并与 ELSD 检测器联用，成功对样品进行了纯化，为极性很强的糖类化合物的制备纯化提供了一种可行的方案。 实验部分 样品信息： 葡萄糖： Glucose，C6H12O6，葡萄糖在生物学领域具有重要地位，是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，即生物的主要供能物质。 果糖： Fructose， C6H12O6，广泛应用于食品、医药、保健品生产中。 乳糖： Lactose， C12H22O11，乳糖主要用于制造婴儿食品和配制药物，例如制药片、药粉时用作稀释剂。 以上样品极性很大，易溶于水，其分子结构式示意图参见图1。 图1.糖类样品分子结构式示意图 由于样品分子极性很大，易溶于水而在有机溶剂中溶解度很低，因此正相分离模式首先被排除。在反相分离模式中， C18反相分离柱是常用的一种通用分离柱，适合各类极性较大样品的分离，因此我们首先尝试用一根 C18反相分离柱对样品进行制备纯化。称取2g葡萄糖，2g果糖，94g乳糖样品溶于50ml水中， 利用注射器取1ml 混合样品上样至 Flash 分离柱上。相同的上样量条件下，我们也尝试用氨基柱进行实验，相较于 C18 反相分离柱，氨基分离柱适用于极性更大的样品纯化，样品的 Flash制备纯化实验参数如表1所示。 表1.]Flash 制备纯化实验参数设置 仪器 SepaBean machine T 色谱柱 25g SepaFlash C18 反相分离柱(超纯无定形C18硅胶，40-63um，100 A，订货号： SW-8201-025-IR) 25 g SepaFlash 氨基分离柱(超纯无定形 NH2 键合硅胶，40-63 um， 60A， 订货号：SW-5501-025-IR) 检测波长 254nm， 280nm，，ELSD 流动相 溶剂A：水，溶剂B：乙腈 流速 30 mL/min 进样量 1ml 洗脱梯度 时间 (Time) 溶剂 B(%) 时间 (Time) 溶剂B (%) 0 95 0 95 30 70 30 70 40 70 40 70 ELSD 检测器参数设定 ELSD 流速 1ml/min 增益值 0 ELSD 温度 60℃ 滤波常数 4s 气压 2.2bar 结果与讨论 样品在普通 C18反相柱上的 Flash 制备图谱如图2所示。分析图2可知，由于样品极性较大，样品在普通 C18反相柱上基本没有保留，随着流动相直接从分离柱上被洗脱下来，未能获得有效的纯化。此外，从 Flash 制备图谱也可以看出，样品在紫外波段没有吸收信号，必须利用外接的 ELSD 检测器才能检测样品的信号。 图2.样品在C18分离柱上的 Flash 制备纯化图谱 实验结果显示普通 C18反相柱对物质保留较弱，这就是常用的反相模式的短板。众所周知，亲水相互作用色谱(hydrophilic interaction chromatography，HILIC) 采用强亲水性的极性固定相，适合于极性较大的样品的分离纯化。因此后考虑采用 HILIC 模式对样品进行制备纯化，如三泰科技推出的 SepaFlash 氨基分离柱，其填料表面键合有极性很强的氨基基团(参见图3)，可以对亲水性化合物样品产生足够的保留作用。 图3. SepaFlash氨基柱固定相键合基团示意图 HILIC 色谱分离模式，与传统正相色谱相似，固定相比流动相具有更强的亲水性，极性物质倾向于与固定相作用，从而增加保留。然后逐渐增加流动相的极性而使样品依次洗脱。但其所用的溶剂又与反相色谱相似，采用与水互溶的极性有机溶剂(一般为乙腈)； 而不用传统正相色谱中所用溶剂(如正己烷、三氯甲烷)。通常以高浓度极性有机溶剂和低浓度水溶液为流动相，其中有机部分是弱溶剂，水溶液是强溶剂。水相比例在洗脱过程中逐步提高，因此适合于极性较大的样品的分离纯化。 利用 SepaFlash 氨基分离柱对样品制备纯化图谱如图4所示。样品在氨基分离柱上获得了有效的保留，三个样品分离度良好，成功对糖类化合物进行了制备纯化。 图4.样品在氨基分离柱上的 Flash制备纯化图谱 氨基柱的键合官能团氨丙基比反相色谱中常用的C18、C8等官能团更容易水解，因此当氨基柱在反相模式下使用时，其使用寿命会稍逊于普通的 C18柱。需要特别注意控制所使用的流动相，流动相 PH 值越低或者含水比例越高造成氨基柱键合相水解的危险就越大。HILIC 模式下，流动相选择时，首先确保流动相中至少含有3~5%的极性溶剂(如5%水，5%甲醇)，以保证氨基柱中的硅胶始终处于被水浸润的状态；其次流动相体系中至少含有50%的有机相(一般情况下，有机相比例尽量不低于70%)。氨基柱使用结束后，为保证其使用寿命，以95%乙腈/5%水作为氨基柱的保存溶剂。若需长期保存不用时，需将氨基柱用异丙醇保存起来。 SepaFlash 氨基柱订购信息 三泰科技推出的 SepaFlash 氨基柱系列产品具有多种规格(参见表2)。 表 2. SepaFlash氨基柱参数 (Ultra-pure irregular NH2， 40 -63 um， 60 A， amino content： 1.3 mmol/g， end-capped，surface area： 500m2/g， loading capacity： 0.1-2%) Item Number Column Size Flow Rate Max.Pressure (mL/min) (psi/bar) SW-5501-004-IR 5.9g 10-20 400/27.5 SW-5501-012-IR 23g 15-30 400/27.5 SW-5501-025-IR 38g 15-30 400/27.5 SW-5501-040-IR 55g 20-40 400/27.5 SW-5501-080-IR 122g 30-60 350/24.0 SW-5501-120-IR 180g 40-80 300/20.7 SW-5501-220-IR 340g 50-100 300/20.7 SW-5501-330-IR 475g 50-100 250/17.2 SepaFlash氨基柱对糖类化合物的制备纯化研究 背景介绍糖类化合物亦称碳水化合物，是多羟基（2个以上）的醛类或酮类化合物，在水解后能变成以上两者之一的有机化合物，在化学上由于其碳、氢、氧元素构成，在化学式的表现上类似于“碳”与“水”的聚合，故又称碳水化合物。糖类主要分为单糖、多糖、低聚糖。所有的糖都是以单糖为基本单位构成，从单糖开始，如葡萄糖和果糖，可以形成双糖、三糖或四糖，甚至有上亿个糖分子组成的复合聚合物--多糖。糖类化合物是植物、动物和微生物的重要组分，与人类生活密切相关，是人体能量的主要来源。它不仅是营养物质，而且有些还具有特殊的生理活性。当其与脂质、肽、蛋白质甚至核酸结合时在医学上有相当大的应用，例如：人需要葡萄糖注射液、右旋糖酐作血浆制剂，肝脏中的肝素有抗凝血作用，血型中的糖与免疫活性有关。此外，核酸的组成成分中也含有糖类化合物--核糖和脱氧核糖。 糖类化合物在医学、营养学、免疫学等方面的应用日益受到越来越多研究人员的重视。糖类化合物缺乏发色基团，导致其无紫外吸收或紫外吸收很弱，传统快速液相色谱法通常只配备紫外 (UV) 检测器，不能检测低含量或缺乏发色团的目标化合物。而低温蒸发光散射检测器（ELSD）作为一种近乎通用的技术，具有紫外检测器不可比拟的优越性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，此外ELSD的检测灵敏度也较高，可检测到更多微弱的信号。本研究探讨使用SepaBean machine快速液相制备色谱系统检测技术对糖类化合物进行制备纯化，结合UV检测器和ELSD检测器（蒸发光散射检测器）共同检测。选取葡萄糖、果糖、乳糖三种样品，由于样品为极性很强的糖类分子，在普通C18反相柱上保留很弱，针对样品的具体性质，应用工程师利用Sepa Flash氨基柱配合快速液相制备色谱系统SepaBean machine并与ELSD检测器联用，成功对样品进行了纯化，为极性很强的糖类化合物的制备纯化提供了一种可行的方案。实验部分样品信息：葡萄糖：Glucose，C6H12O6，葡萄糖在生物学领域具有重要地位，是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，即生物的主要供能物质。果糖：Fructose，C6H12O6，广泛应用于食品、医药、保健品生产中。乳糖：Lactose，C12H22O11，乳糖主要用于制造婴儿食品和配制药物，例如制药片、药粉时用作稀释剂。以上样品极性很大，易溶于水，其分子结构式示意图参见图1。 图1. 糖类样品分子结构式示意图由于样品分子极性很大，易溶于水而在有机溶剂中溶解度很低，因此正相分离模式首先被排除。在反相分离模式中，C18反相分离柱是常用的一种通用分离柱，适合各类极性较大样品的分离，因此我们首先尝试用一根C18反相分离柱对样品进行制备纯化。称取2g葡萄糖，2g果糖，4g乳糖样品溶于50ml水中，利用注射器取1ml混合样品上样至Flash分离柱上。相同的上样量条件下，我们也尝试用氨基柱进行实验，相较于C18反相分离柱，氨基分离柱适用于极性更大的样品纯化，样品的Flash制备纯化实验参数如表1所示。表1.  Flash制备纯化实验参数设置仪器SepaBean  machine T色谱柱25g SepaFlash C18反相分离柱(超纯无定形C18硅胶， 40 - 63 μm，100 Å，订货号：SW-8201-025-IR)25 g SepaFlash氨基分离柱 (超纯无定形NH2键合硅胶， 40 - 63 μm，60 Å，订货号：SW-5501-025-IR)检测波长254 nm，280 nm， ELSD流动相溶剂A：水，溶剂B：乙腈流速30 mL/min进样量1ml洗脱梯度时间 (Time)溶剂B (%)时间 (Time)溶剂B (%)0950953070307040704070ELSD检测器参数设定ELSD流速1ml/min增益值0ELSD温度60℃滤波常数4s气压2.2bar结果与讨论样品在普通C18反相柱上的Flash制备图谱如图2所示。分析图2可知，由于样品极性较大，样品在普通C18反相柱上基本没有保留，随着流动相直接从分离柱上被洗脱下来，未能获得有效的纯化。此外，从Flash制备图谱也可以看出，样品在紫外波段没有吸收信号，必须利用外接的ELSD检测器才能检测样品的信号。图2. 样品在C18分离柱上的Flash制备纯化图谱实验结果显示普通C18反相柱对物质保留较弱，这就是常用的反相模式的短板。众所周知，亲水相互作用色谱（hydrophilic interaction chromatography, HILIC）采用强亲水性的极性固定相，适合于极性较大的样品的分离纯化。因此后考虑采用HILIC模式对样品进行制备纯化，如三泰科技推出的SepaFlash 氨基分离柱，其填料表面键合有极性很强的氨基基团（参见图3），可以对亲水性化合物样品产生足够的保留作用。 图3. SepaFlash氨基柱固定相键合基团示意图  HILIC色谱分离模式，与传统正相色谱相似，固定相比流动相具有更强的亲水性，极性物质倾向于与固定相作用，从而增加保留。然后逐渐增加流动相的极性而使样品依次洗脱。但其所用的溶剂又与反相色谱相似，采用与水互溶的极性有机溶剂 (一般为乙腈)； 而不用传统正相色谱中所用溶剂(如正己烷、三氯甲烷) 。通常以高浓度极性有机溶剂和低浓度水溶液为流动相，其中有机部分是弱溶剂, 水溶液是强溶剂。水相比例在洗脱过程中逐步提高，因此适合于极性较大的样品的分离纯化。利用SepaFlash氨基分离柱对样品制备纯化图谱如图4所示。样品在氨基分离柱上获得了有效的保留，三个样品分离度良好，成功对糖类化合物进行了制备纯化。图4. 样品在氨基分离柱上的Flash制备纯化图谱氨基柱的键合官能团氨丙基比反相色谱中常用的C18、C8等官能团更容易水解，因此当氨基柱在反相模式下使用时，其使用寿命会稍逊于普通的C18柱。需要特别注意控制所使用的流动相，流动相PH值越低或者含水比例越高造成氨基柱键合相水解的危险就越大。HILIC模式下，流动相选择时，首先确保流动相中至少含有3~5%的极性溶剂（如5%水，5%甲醇），以保证氨基柱中的硅胶始终处于被水浸润的状态；其次流动相体系中至少含有50%的有机相（一般情况下，有机相比例尽量不低于 70%）。氨基柱使用结束后，为保证其使用寿命，以95%乙腈/5%水作为氨基柱的保存溶剂。若需长期保存不用时，需将氨基柱用异丙醇保存起来。  SepaFlash 氨基柱订购信息三泰科技推出的SepaFlash 氨基柱系列产品具有多种规格（参见表2）。表2. SepaFlash 氨基柱参数（Ultra-pure irregular NH2, 40 – 63 μm, 60 Å, amino content: 1.3 mmol/g, end-capped, surface area: 500m2/g, loading capacity: 0.1-2%）Item NumberColumn SizeFlow Rate(mL/min)Max.Pressure(psi/bar)SW-5501-004-IR5.9 g10-20400/27.5SW-5501-012-IR23 g15-30400/27.5SW-5501-025-IR38 g15-30400/27.5SW-5501-040-IR55 g20-40400/27.5SW-5501-080-IR122 g30-60350/24.0SW-5501-120-IR180 g40-80300/20.7SW-5501-220-IR340 g50-100300/20.7SW-5501-330-IR475 g50-100250/17.2 如需进一步了解SepaBean machine的详细规格信息，或配套使用的Flash纯化柱订购信息，请访问ChemBeanGo在线商店