牛奶中喹诺酮类药物多残留检测方案(液相色谱仪)

月旭科技(上海)1股份有限公司 牛奶中喹诺酮类药物多残留的测定 GB 29692-2013 1、适用范围 本方法规定了牛奶中喹诺酮类药物残留量检测的高效液相色谱测定方法。 本标准适用于牛奶中达氟沙星、恩诺沙星和环丙沙星药物残留量的检测。(本实验样品为牛奶) 参考标准： 《GB 29692-2013牛奶中喹诺酮类药物多残留的测定 高效液相色谱法》 2、.溶液的配置 1) 5.0mol/L 氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠固体于 100mL容量瓶中，用水定容至刻度。 2)0.1mol/L氢氧化钠溶液：量取2.0mL5.0mol/L 氢氧化钠溶液于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。 3)10%三氯乙酸溶液：称取10.0g三氯乙酸，用水稀释并定容至100mL。 4)乙腈-10%三氯乙酸溶液：量取10mL乙腈，用10%三氯乙酸溶液稀释并定容至100mL。 5)10%甲醇水溶液：量取甲醇10mL，用水稀释并定容至100mL。 6)柠檬酸/乙酸铵缓冲液：称取柠檬酸10.56g、乙酸铵 7.87g，用水溶解并稀释至1000mL，用乙酸调pH至4.0，滤膜过滤。 7)乙腈-柠檬酸/乙酸铵缓冲液：取乙腈8mL，用柠檬酸/乙酸铵缓冲液溶解并稀释至100mL。 8)达氟沙星标准储备液：称取5mg达氟沙星标准品，用甲醇定容至10mL，配制成 500ug/mL 的标准储备液。 9)恩诺沙星标准储备液：称取 5mg 恩诺沙星标准品，用甲醇定容至10mL，配制成 500ug/mL 的标准储备液。 10)环丙沙星标准储备液：称取5mg环丙沙星标准品，用 0.1mol/L氢氧化钠溶液定容至10mL， 配制成 500ug/mL 的标准储备液。 11)达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星标准工作液：分别都吸取三种标准储备液各0.4mL，用 0.1mol/L 氢氧化钠溶液分别都定容到10mL， 配置成对应的 20ug/mL的标准工作液。 12)混合标准工作液：吸取 0.1mL达氟沙星标准工作液、0.5mL 恩诺沙星、环丙沙星标准工作液，混合，再用 0.1mol/L 氢氧化钠溶液定容至10mL，配制成混合工作液。 3、提取步骤 准确称取牛奶样品 1.0g 于15mL离心管中，加入乙腈-10%三氯乙酸溶液5.0mL，混匀，超声5min， 8000r/min 离心 10min， 取上清液备用。 4、净化步骤 SPE柱：月旭 Welchrom@ BRP小柱，规格：60mg/3mL 活化：3mL甲醇，3mL水，弃去； 上样：所有上清液，弃去； 淋洗：3mL10%甲醇水溶液，抽干，弃去； 洗脱：：3mL甲醇，抽干，收集； 收集到的洗脱液于60℃下氮气吹干，用乙腈-柠檬酸/乙酸铵缓冲液500uL 溶解残留物，涡旋混匀， 8000r/min 离心 10min，取上清液过 0.22um微孔滤膜，供上机检测。 5、注意事项 1)加标水平：1g样品中加入25uL 混合工作液，因此达氟沙星加标水平为 5ug/kg，最终机度数为 10ng/mL；恩诺沙星、环丙沙星加标水平为 25ug/kg，最终机度数为 50ng/mL。 6、色谱条件 6.1高效液相色谱条件 色谱柱：月旭 UltimateRXB-C18，4.6x250mm，5um 流速：1.5mL/min 柱温：50℃ 进样量：20uL 荧光检测器： 时间/min 激发波长Ex/nm 发射波长 Em/nm 0 278 465 23.4 312 366 32.0 278 465 洗脱程序： 时间/min 乙腈/% 柠檬酸/乙酸铵缓冲溶液 /% 0.01 8 92 30.0 55 45 32.0 8 92 35.0 8 92 7、色谱图或者加标回收率结果 mV 图1.达氟沙星 10ng/mL，恩诺沙星、环丙不星 50ng/mL 图谱 峰名称 保留时间 峰面积 峰高 相对峰面积 拖尾因子 塔板数 min mV*min mV % (EP) (EP) 环丙沙星 9.860 359804 50002 19.108 1.113 42506 达氟沙星 10.561 738438 101616 39.217 1.118 48636 恩诺沙星 11.354 784732 105225 41.675 1.123 53569 图2.牛奶样品空白图谱 图3.牛奶样品达氟沙星加星 5ug/kg，恩诺沙星、环丙沙星加标 25ug/kg 图谱 表1.加标回收率表 物质 加标水平 平均回收率 RSD 值(n=2) 达氟沙星 5ug/kg 78.47% 0.79% 恩诺沙星 25ug/kg 75.36% 0.26% 环丙沙星 25ug/kg 79.01% 2.88% 8、相关产品信息 货号 名称 规格 00522-20009 SPE小柱 Welchrom@ BRP，60mg/3mL， 50pk 00837-05002 15mL 螺口尖底离心管 离心管一次性离心管，平盖，平形底，RCF12000xg，袋装，未灭菌，15mL， 50/包 00824-31001 Welch 固相萃取装置 12位方缸 00821-32291 盖子+垫片 预切口红色特氟龙/白色硅胶隔垫，9mm蓝色短螺纹开口盖中心孔6mm 100pk 00821-40927 样品瓶 2mL 透明短螺纹广口样品瓶带书写处11.6*32mm 一级水解玻璃 100pk 00201-31043 液相色谱柱 UltimateR XB-C18，4.6×250mm， 5um 00802-02201 针头式过滤器 进口NY，13mm*0.22um，100pk 达氟沙星标准品 CAS：112398-18-0 恩诺沙星标准品 CAS：93106-60-6 环丙沙星标准品 CAS：85721-33-1 海松江启迪漕河泾(中山)科技园紫荆园楼 1）5.0mol/L 氢氧化钠溶液：称取 20g 氢氧化钠固体于 100mL 容量瓶中，用水定 容至刻度。 2）0.1mol/L 氢氧化钠溶液：量取 2.0mL5.0mol/L 氢氧化钠溶液于 100mL 容量瓶 中，用水定容至刻度。 3）10%三氯乙酸溶液：称取 10.0g 三氯乙酸，用水稀释并定容至 100mL。 4）乙腈-10%三氯乙酸溶液：量取 10mL 乙腈，用 10%三氯乙酸溶液稀释并定容 至 100mL。 5）10%甲醇水溶液：量取甲醇 10mL，用水稀释并定容至 100mL。 6）柠檬酸/乙酸铵缓冲液：称取柠檬酸 10.56g、乙酸铵 7.87g，用水溶解并稀释 至 1000mL，用乙酸调 pH 至 4.0，滤膜过滤。 7）乙腈-柠檬酸/乙酸铵缓冲液：取乙腈 8mL，用柠檬酸/乙酸铵缓冲液溶解并稀 释至 100mL。