细胞培养中降低支原体污染检测方案(移液器)

SARTORIUS 简介 应用说明 2020年4月 关键词或短语： 支原体；移液；去除污染；细胞培养；滤芯吸头；避免污染 尽可能降低细胞培养中的支原体污染风险了解其来源及预防措施 Emilia Varhimol，Sandra Soderholm² 1.移液及分液，赛多利斯百得液体处理，芬兰赫尔辛基 2.实验室基本应用程序开发，赛多利斯百得液体处理，芬兰赫尔辛基 通讯作者 电子邮箱： Ihinfo.Finland1@Sartorius.com 摘要 在细胞培养实验室中，预防支原体污染可能是一项艰巨的任务。但是，您可以选择易于清洁的移液器以及无菌耗材并定期检测，来执行良好的细胞培养规范，从而显著降低细胞培养实验室的支原体污染及传播风险。 在细胞培养实验室中，支原体(如图1所示)污染是一种普遍存在的现象：在一项研究中，研究人员测试了10000个细胞系，发现其中的11%存在支原体污染(Olarerin George等人，2015年)。支原体污染如此普遍的部分原因在于，即使在常规继代培养中，其也能有效地传播。而在另一项研究中，研究人员在层流净化罩中处理受支原体感染的细胞培养物后，在烧瓶外壁、血细胞计数器上、移液器上以及废弃盘外部都检测到了活支原体。事实上，甚至在四到六天之后，从层流罩表面也回收到了活支原体。并且在处理过受支原体污染的细胞的同一个层流净化罩内继代培养纯净的培养物6周后，也检测到支原体呈阳性(见Nikfarjam等人2012的综述，原始文章为McGarrity GJ， 1976年)。 图1.扫描电子显微镜 截留在 0.1 umPES膜上的支原体(A.laidlawii)图像。 支原体是一类没有细胞壁的细菌。由于缺少细胞壁，它们可以呈现不同的形状，从圆形到细长形都有，并对抗生素具有耐药性(Bebear等人，2011年)。支原体体积小(0.2-0.8um)，可穿过除菌级过滤器，这使其成为一种非常很难以去除的污染物。此外，体积小也导致其难以在细胞培养中被发现(Masters等人，2007年；Volokhov等人，2008年)。 在细胞培养中，支原体可抑制蛋白质生物合成以及细胞生长，并会改变RNA和DNA合成，从而影响研究结果。在细胞疗法和先进治疗药物产品(ATMP)中，支原体污染会引起免疫反应、染色体畸变或增殖特性改变，从而影响患者的治疗安全性(Martins等人，2014年)。 支原体污染的潜在途径包括： ·受污染的培养基、试剂或仪器 ·实验室人员(约80.6%的技术人员为支原体携带者) ·其他实验室的被感染培养物 支原体留存在移液器表面 移液器经常暴露在污染物中，并可能携带污染物。因此，大多数移液器的设计或可整体高压灭菌，或其分液头部件可高压灭菌。我们进行了一项研究，对高压灭菌和乙醇擦拭的去污效率进行了比较。我们在限定区域用10^6支原体CFU污染了三支移液器的表面，然后将它们在层流条件下放置24小时。随后，对移液器进行高压灭菌或用乙醇擦拭灭菌。对移液器进行高压灭菌后，没有回收到支原体，而用70%的乙醇擦拭后，回收到的支原体数量约为100 CFU(见图2)。而24小时后，在未进行任何去除污染处理的移液器上回收到了约10000个CFU，这表明支原体可在移液器表面存活。 这一结果重述了Eterpi等人(2010年)在类似研究中的结果。他们发现，用70%乙醇去污可使回收到的细菌数量减少一个对数级以上。他们还发现，对移液器进行高压灭菌可以完全去除其中的支原体污染。 为降低支原体污染风险，请使用可高压灭菌的移液器进行细胞培养工作。赛多利斯整支可高压灭菌的Tacta移液器是所有细胞培养工作的好选择。 避免支原体污染的良好实践 您可以通过以下操作规程进行无污染的细胞培养： 1.实施良好细胞培养规范 《良好的细胞培养规范》(Coecke S，2005)是一套通用的细胞培养指南，指导在不使用抗生素的情况下避免污染。不建议在细胞培养基中经常使用抗生素。抗生素不仅常常对支原体无效，而且还会促进抗生素耐药性，并掩盖低水平的持续污染情况(DrexlerU及phoff，2002年)。此外，培养基中的抗生素还可能会影响细胞培养实验的结果。 《良好的细胞培养规范》中的关键指导原则包括：一次只培养一个细胞系；清晰标记用于细胞培养工作的移液器、移液助吸器及移液器吸头；仅在细胞培养实验室使用这些移液器和吸头；禁止将其从细胞培养实验室转移到另一个实验室，然后再转移回来。只能使用专为细胞培养工作指定的试剂，不得使用专用于其他应用的储备溶液。 2.选择易于清洁且可高压灭菌的移液器用于细胞培养工作 液体溢漏和飞溅是造成污染的主要来源，而移液器和液体处理控制器的维护在降低这类污染风险方面发挥着重要的作用。实验室应针对定期的去除污染和维护作业制定相关指南和方案。根据Eterpi等人(2010年)发表的论文，去除细菌污染的有效清洁方法包括： 高压灭菌 ▪碱性清洁剂 ·乙醇过氧化氢蒸汽VHP 各种移液器不同的设计会对移液器的清洁方案造成深远的影响。例如，根据其设计差异，移液器可以拆分为三到二十多个部件。为了使清洁和灭菌更加轻松且可靠，请选择整支可高压灭菌、易于清洁且能耐受有效清洁方法的移液工具，如赛多利斯的Tacta移液器。 3.选择带有防护包装的无菌滤芯吸头 滤芯吸头是细胞培养工作中最安全的选择，因其为样本和移液器提供了最好的防护，并且可以防止支原体通过气溶胶传播。高压灭菌不适用于滤芯吸头，因为滤芯的材质为聚乙烯，不耐受高温。因此，移液器吸头预灭菌时通常采用电子束(B)辐照灭菌。赛多利斯使用电子束预灭菌，其无菌保证水平(SAL)为10。这意味着在100万个经过灭菌的物品中，最多只可能存在一个活的微生物。该SAL水平被药典灭菌程序接受。赛多利斯每年会经由独立的剂量审计对电子束辐射剂量进行四次评估。 吸头盒存放在仓库和实验室货架上时，其表面会聚集灰尘和污垢。因此，请选择独立包装的吸头盒，因为包装可确保储存期间的无菌性。仅在使用前打开包装，并将拆封的吸头盒直接放入超净工作台中，以尽可能减少将污染带入洁净的工作区域。 定期检测所有细胞系的支原体污染情况，尤其是新细胞系。将新细胞系隔离在单独的培养箱中，直到可以明确证明其未受支原体污染。一些常见的支原体检测方法及其优缺点可参见表1。许多研究人员都喜欢使用支原体PCR/qPCR试剂盒，因为它们非常灵敏并可快速获得结果。由于大多数实验室都配有PCR/qPCR仪，这类检测很容易进行。 方法 优点 缺点 微生物培养 +高灵敏度及特异性 ▪需要特殊的微生物学实验室 ·速度慢(最长需要28天) 直接DNA染色 +快速且经济 ·结果难以解读，主观性强 (DAPI，Hoechst) ·灵敏度非常低 支原体试剂盒 +快速且灵敏高 ·无法区分活菌和死菌 5.使用0.1um的滤器过滤 高压灭菌是杀死支原体的有效方法，但不适用于某些培养基和试剂，因为高温会破坏许多营养素和生长因子。对于细胞大小为0.2-0.8um且可通过孔径大于0.1um孔的支原体而言，能有效防止细菌和真菌通过的孔径为 0.22um的标准无菌过滤通常是不够的。因此，为防止支原体污染，在过滤细胞培养试剂和培养基时，应使用 0.1um孔径的无菌过滤器，而不是标准的 0.22 um过滤器(Roche等人，1992年)。 ( 参考文献 ) Bebear C， Pereyre S， Peuchant O. Mycoplasmapneumoniae： susceptibility and resistance to antibiotics.Future Microbiol (2011)； 6；423-431. Coecke S， Balls M， Bowe G， Davis J，GstraunthalerG，Hartung T， Hay R，Merten O-W. Guidance on Good CellCulture Practice.ATLA (2005)； 33；261-287. Eterpi M， McDonnell G， Thomas V. Decontaminationefficacy against Mycoplasma.Letters in AppliedMicrobiology (2010)；52；150-155. Martins JP， Santos JM， de Almeida JM， Filipe MA， deAlmeida MV，Almeida SC，Agua-Doce A， Varela A (2014).Towards an advanced therapy medicinal product based onmesenchymal stromal cells isolated from the umbilical cordtissue： quality and safety data. Stem Cell Res Ther (2014)；5(1)；9. Masters JR，Stacey GN. Changing medium and passagingcell lines. Nat. Protoc. (2007)；2；2276-2284. McGarrity GJ. Spread and control of mycoplasmal infectionof cell cultures. In vitro (1976)；12(9)；643-648. Nikfarjam L & Farzaneh P. Prevention and Detection ofMycoplasma Contamination in Cell Culture. Cell J (2012)；13(4)；203-212. ( Olarerin-George AO & Hogenesch JB. Assessing theprevalence of mycoplasma contamination in cell culture viaa survey of NCBI's RNA-seq archive. Nucl Acid Res ( 2 015)； 43(5)；2535-2542. ) ( Roche KL， Levy RV. Methods used to validate microporousmembranes for the removal of Mycoplasma. Biopharm 1992：22-33. ) ( Volokhov DV， Kong H ， GeorgeJ， Anderson C， Chizhikov VE.Biological enrichment of mycoplasma agents bycocultivation with permissive cell cultures.Appl.Environ. Microbiol.(2008)；74；5383-5391. ) 销售与服务联系方式 更多联系信息，请访问 www.sartorius.com.cn 赛多利斯(上海)贸易有限公司 邮箱lab.cn@sartorius.com 服务热线 400 920 9889|800 820 9889 上海北京上海市浦东新区盛荣路 388北京市顺义区空港工业区 B弄百佳通产业园3号楼区裕安路 33号， 1013007-11层，200120电话+86 10 8042 6300 电话+86 21 6066 6100苏州广州 苏州市虎丘区科技城锦峰路广州市越秀区水荫路 117 号 158 号 101park-28 幢201，1105单元， 510075 215163电话+8620 3761 7284 电话+86512 6616 0490 成都西安成都市上东大街 246号新良西安市和平路 118 号和平银大厦2406室， 610012座1107室， 710001电话+86 28 8666 6877电话 +86 29 87512305 ( 技木规格如有变更，恕不另行通知。 ) ( 赛多利斯保留最终解释权和修改权。 ) ( 版本02|2022 ) 了解更多： www.sartorius.com/en/products/pipetting-and-dispensing Overview在细胞培养实验室中，预防支原体污染可能是一项艰巨的任务。但是，您可以选择易于清洁的移液器以及无菌耗材并定期检测，通过执行良好的细胞培养规范，从而显著降低细胞培养实验室的支原体污染及传播风险。Download《尽可能降低细胞培养中的支原体污染风险》应用说明阐述了支原体污染的来源及预防措施。点击下载 获取全文简介在细胞培养实验室中，支原体污染是一种普遍存在的现象：在一项研究中，研究人员测试了 10, 000 个细胞系，发现其中的 11 % 存在支原体污染。支原体污染如此普遍的部分原因在于，即使在常规传代培养中，其也能有效地传播。而在另一项研究中，研究人员在层流净化罩中处理受支原体感染的细胞培养物后，在烧瓶外壁、血细胞计数器上、移液器上以及废弃培养皿外部都检测到了活支原体。事实上，甚至在四到六天之后，从层流罩表面也回收到了活支原体。并且在处理过受支原体污染的细胞的同一个层流净化罩内传代培养纯净的培养物 6 周后，也检测到支原体呈阳性。什么是支原体支原体是一类没有细胞壁的细菌。由于缺少细胞壁，它们可以呈现不同的形状，从圆形到细长形都有，并对抗生素具有耐药性。支原体体积小（0.2 – 0.8 μm），可穿过除菌级过滤器，这使其成为一种非常难以去除的污染物。此外，体积小也导致其难以在细胞培养中被发现。在细胞培养中，支原体可抑制蛋白质生物合成以及细胞生长，并会改变RNA和DNA合成，从而影响研究结果。在细胞治疗和先进治疗药物产品（ATMP）中，支原体污染会引起免疫反应、染色体畸变或增殖特性改变，从而影响患者的治疗安全性。支原体污染的潜在途径包括：- 受污染的培养基、试剂或仪器- 实验室人员（约 80.6 %的技术人员为支原体携带者）- 其他实验室的被感染培养物支原体留存在移液器表面移液器经常暴露在污染物中，并可能携带污染物。通过对移液器高压灭菌和乙醇擦拭的去污效率比较显示，用 70 %乙醇去污可使回收到的细菌数量减少一个对数级以上，而对移液器进行高压灭菌可以完全去除其中的支原体污染。为降低支原体污染风险，请使用可高压灭菌的移液器进行细胞培养工作。赛多利斯整支可高压灭菌的Tacta®移液器是细胞培养工作的好选择。避免支原体污染的良好实践您可以通过以下操作规程进行无污染的细胞培养：1. 实施良好细胞培养规范《良好的细胞培养规范》中的关键指导原则包括：一次只培养一个细胞系；清晰标记用于细胞培养工作的移液器、移液助吸器及移液器吸头；仅在细胞培养实验室使用这些移液器和吸头；禁止将其从细胞培养实验室转移到另一个实验室，然后再转移回来。只能使用专为细胞培养工作指定的试剂，不得使用专用于其他应用的储备溶液。2. 选择易于清洁且可高压灭菌的移液器用于细胞培养工作液体溢漏和飞溅是造成污染的主要来源，而移液器和液体处理控制器的维护在降低这类污染风险方面发挥着重要的作用。实验室应针对定期的去除污染和维护作业制定相关指南和方案。去除细菌污染的有效清洁方法包括：- 高压灭菌- 碱性清洁剂- 乙醇过氧化氢蒸汽VHP赛多利斯Tacta®移液器只需拆卸三个部件即可清洁，而且拆卸操作无需使用工具。Tacta® 还可以整支进行蒸汽消毒或热压灭菌，它还具有强大的紫外线耐受力和耐化学腐蚀性。3. 选择带有防护包装的无菌滤芯吸头滤芯吸头是细胞培养工作中安全的选择，因其为样本和移液器提供了优质的防护，并且可以防止支原体通过气溶胶传播。4. 定期检测定期检测所有细胞系的支原体污染情况，尤其是新细胞系。将新细胞系隔离在单独的培养箱中，直到可以明确证明其未受支原体污染。赛多利斯Microsart支原体检测试剂盒，采用RT-PCR的方法， 3小时内即可获得可靠结果。高特异性Taqman探针，无需担心假阳性结果，并且完全符合EP 2.6.7法规要求。5. 使用 0.1 μm的滤器过滤高压灭菌是杀死支原体的有效方法，但不适用于某些培养基和试剂，因为高温会破坏许多营养素和生长因子。对于细胞大小为 0.2 - 0.8 μm且可通过孔径大于 0.1 μm孔的支原体而言，能有效防止细菌和真菌通过的孔径为 0.22 μm的标准无菌过滤通常是不够的。因此，为防止支原体污染，在过滤细胞培养试剂和培养基时，应使用 0.1 μm孔径的无菌过滤器，而不是标准的 0.22 μm过滤器。更多详细解读 敬请下载全文