蛋白中表达量变化检测方案(蛋白质纯化)

毗 V OS6-5eJQ EMT即上皮间质转化，在此过程中，上皮细胞的极性丧失，迁移和运动能力增强，同时上皮表型丢失而逐渐获得间质表型。伴随表型变化，许多基因的表达发生了改变，上皮表型相关蛋白，如角蛋白、E-钙粘蛋白、紧密连接蛋白-1、闭锁小带蛋白等含量下降，间质表型相关蛋白，如波形蛋白、N-钙粘蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、纤维连接蛋白等含量上升，同时一系列转录因子的表达也发生了变化。角蛋白  细胞角蛋白（cytokeratin CK）主要分布于上皮细胞，是角质细胞中的主要骨架蛋白，这种结构蛋白的主要功能是维持上皮组织的完整性及连续性。细胞角蛋白作为一种中间丝，存在于所有上皮细胞及部分非上皮细胞。研究发现细胞角蛋白（CK）具有极高的保守性和组织分化特异性，与上皮细胞的增殖分化密切相关。2‍E-钙粘蛋白  E-钙粘蛋白（E-Cadherin）是上皮细胞与特征性钙粘蛋白粘附通路的关键组分，依赖Ca2+介导的细胞之间的粘附，会诱导E-钙粘蛋白分子迅速定位到接触位置，并介导同种相邻细胞间相互粘附。3‍紧密连接蛋白-1  紧密连接蛋白-1（Claudin-1）是构成紧密连接的骨架蛋白，对维持机体内环境稳定、细胞屏障、保持细胞极性和调节细胞运动分化等具有重要的意义。4‍闭锁小带蛋白  闭锁小带蛋白（zonula occludens-1, ZO-1）蛋白存在于所有脊椎动物的紧密连接中，通过与细胞内骨架系统相连接，在细胞间构成稳定的连接系统。ZO-1在维持正常细胞间屏障、细胞通透性、细胞信号转导、基因转录调节、细胞增殖分化中发挥着非常重要的作用。5‍波形蛋白  波形蛋白 (vimentin) 是间质细胞中最主要的中间纤维,它存在于中胚层起源的细胞中，如成纤维细胞、内皮细胞和白细胞等，并与微管、微丝共同形成了一个细胞支架网络而维持细胞完整性。6‍N-钙粘蛋白  N-钙粘蛋白（N-Cadherin）是一种非上皮性钙粘蛋白，主要表达于纤维母细胞、神经组织和肌肉组织中，能够促进上皮细胞与间质细胞之间的相互粘附。7‍α-平滑肌肌动蛋白  α-平滑肌肌动蛋白（α - smooth muscleactin，α - SMA）主要存在于平滑肌细胞与肌成纤维细胞中，α – SMA表达量上调是细胞纤维化的重要指标。‍8纤维连接蛋白  纤维连接蛋白（fibronectin，FN）由间质细胞分泌，广泛分布于人体细胞表面和血浆中。有促进巨噬细胞的吞噬功能，促进细胞与纤维基质间连接的生理作用。纤连蛋白与机体创伤修复、组织炎症、纤维化及硬化过程等有密切关系。9‍Snail   Snail蛋白是一种转录抑制因子，能够抑制E-钙粘蛋白的表达，进而诱导EMT发生，将Snail转染至E-钙粘蛋白阳性的细胞中将诱导EMT的发生并表达间质细胞标志物。10‍Slug  Slug蛋白与Snail蛋白属于同一个转录因子家族，表达在上皮细胞和未分化的间质细胞中，维持未分化表型，与Snail蛋白相同，Slug蛋白能够抑制E-钙粘蛋白的表达，进而诱导EMT发生。11‍Twist  Twist是一种在EMT中居于重要地位的转录因子，不仅在发育中发挥重要作用，同时还具有促进肿瘤浸润和转移的能力，在多种恶性肿瘤中具有高水平的表达。  12‍Zeb1  Zeb1 是Zeb（zinc-finger E box –binding homeobox1）转录因子家族的重要组分，Zeb1的表达水平与E-钙粘蛋白的表达水平呈负相关，Zeb1结合于E-钙粘蛋白的E box序列，使E-钙粘蛋白的转录受到抑制。13‍β-catenin  β-catenin 是Wnt 信号通路的重要组分，异常活化的Wnt 信号将导致β-catenin水平上调，上调的β-catenin将进入细胞核与TCF/LEF信号通路发生作用，激活下游众多靶基因的过度表达，是参与 EMT发生的重要蛋白。蛋白表达量的变化多通过Western Blot和免疫荧光及免疫组化的方式来检测，其中Western Blot可以使用组织和细胞实现蛋白的定性和半定量，免疫荧光可以使用细胞爬片检测细胞中蛋白的定位以及定性分析，免疫组化可以使用组织切片检测细胞中蛋白的定位以及定性分析，针对不同的样品类型，可以采用不同方式来检测EMT导致的蛋白表达变化。