油茶中黄曲霉毒素总量检测方案(恒流泵)

高效液相色谱-柱后光化学衍生法测定油茶中黄曲霉毒素的方法研究 目的建立高效液相色谱-柱后光化学衍生法测定油茶中黄曲霉毒素含量的方法。方法市售油茶油样品，经80%甲醇水溶液提取、离心，吸取上清液稀释，专用免疫亲和柱净化后，采用高效液相色谱仪带荧光检测器串联柱后光化学衍生器测定黄曲霉毒素。同时，对样品提取条件的选择、样品净化过程、流动性比例选择等进行优化实验研究。结果黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2在0.5~50 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r'>0.9999，在0.5ug/kg(检出限)、10 ug/kg(限量)添加水平下的回收率为 88.4%~104.5%，相对标准偏差0.3%~6%。结论该方法简单、准确、重现性好，适用于油茶中黄曲霉毒素的定量分析。 黄曲霉毒素是迄今发现的毒性最大的真菌毒素，是世界公认的3大强致癌物质之一。黄曲霉毒素主要污染粮油制品，，易在玉米、稻谷、花生、桃仁、果仁、坚果等油脂含量较高的粮食作物上生长。我国国家标准 GB 2761—2017 规定食用油中黄曲霉毒素B1的限量标准不得高于 10ug/kg。目前针对植物油中黄曲霉毒素的检测主要依据食品中黄曲霉毒素的检测方法如：高效液相色谱法、同位素稀释液相色谱-串联质谱法、酶联免疫法，茶油中黄曲霉的检测相关文件少之又少。本研究基于 HPLC-柱后光衍生的基础上结合免疫亲和浓缩富集，建立一种准确、高效的测定和确证茶油中黄曲霉毒素的方法。 1实验部分 1.1试验材料 尚野山茶油(油茶籽油-安徽尚野茶油有限公司)；纯正茶油(油茶籽油-浙江久晟茶油科技股份有限公司) 1.2仪器与试剂 高效液相色谱法-带荧光检测器(岛津)；光化学柱后衍生器(Pribolab@KRC光化学柱后衍生器)；超声波清洗装置；涡旋仪；分析天平；固相萃取装置(Pribolab@ 8 位泵流操作架)；黄曲霉毒素免疫亲和柱 (PriboFast@黄曲霉素总量免疫亲和柱3ml)。 甲醇(色谱纯)； Pribolab@ PBS 缓冲液；高纯水；黄曲霉毒素标准品 (Pribolab@25Hg/mL 黄曲霉毒素(Aflatoxin)B1， G1，B2，G2/甲醇)。 1.3实验方法 1.3.1试样处理准确称取5.00g油样于50mL 离心管中，加1.0g氯化钠；加25mL70%甲醇水，涡旋混匀，置于超声波或涡旋振荡器中振荡 30min；过玻纤滤纸，取5mL滤液，加20mL PBS 溶液稀释混匀，备用。冷藏条件下储存的黄曲霉毒素免疫亲和柱取出后恢复至室温，移取上述提取液全部重力过柱，分别用10mLPBS和10mL 一级水加压清洗，弃去全部流出液，并使2~3mL 空气通过柱体；以2.0mL 色谱级甲醇分两步进行洗脱，重力洗脱。最后轻微加压排净洗脱液，0.22um 滤膜过滤，待测。 1.3.2分析条件色谱柱： PRIBOLAB ODS C18液相色谱柱(5um， 4. 6mm×150mm)；流动相：：甲醇：水=45：5555，等度洗脱；流速1mL/min； 进样量：20pL；激发波长：360nm：1；发射波长：440nm。 2结果与结论 2.1样品前处理 比较甲醇、乙腈、正己烷后，得出70%甲醇水提取效果较好，溶剂中油脂含量明显较低，回收率可达85%以上；由于茶叶基质复杂，在过柱净化时，使用0.5%吐温-PBS稀释后上样，可有效减少色素等杂质在柱体上的吸附，，上样完毕后，继续用 PBS 溶液进行淋洗，淋洗体积可视样品情况而定，一般需要10mL。如果排出的淋洗液中还有颜色，可适当增加淋洗液体积。最后用水再淋洗，以减少表面活性剂对仪器的不良影响。 2.2仪器条件 流动相选择甲醇：水=45：55，使用150mm的 C18色谱柱，可以在20分钟出AFTG2、G1、B2、B1四个峰，串联 Pribolab@ KRC 光化学柱后衍生器增强 AFTG1、B1的荧光强度，响应高，峰型好。 2.3工作曲线和最小检出限 准确吸取 40uL 25ug/mL的黄曲霉毒素标准溶液，用甲醇定容至1mL，制得1ug/mL的储备液，逐级稀释成0.5，1，5，10，50 ug/L 的标准系列溶液，按浓度由低到高的顺序进样，选定的色谱条件下测定，横坐标为浓度，纵坐标为峰面 积，进行线性回归计算。结果表明黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2在0.5~50 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r’>0.9999。计算3倍信噪比时所对应的样品浓度，得到的方法检出限为 0.05 u g/kg、0.03 u g/kg、0.1ug/kg、0.04u g/kg. 黄曲霉毒素 G2 G1 B2 B1标准曲线、回归方程、相关系数 1ug/L与茶油样品 0.5 ug/L添加的液相谱图 2.4精确度与回收率 两种茶油样品，分别做了0.5ng/kg(检出限)、10ug/kg(限量)的添加，10ug/kg 的样品都做了平行实验。方法的回收率为88.4%~104.5%，相对标准偏差为0.3%~6%。 样品名称 AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 峰面积 浓度 含量 回收率 峰面积 浓度 含量 回收率 峰面积 浓度 含量 回收率 峰面积 浓度 含量 回收率 茶油1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 / 0 0 0 / 茶油1-add0.5 16009 0.238 0.476 95.2 29638 0.273 0.546 109.2 6002 0.251 0.502 100.4 15462 0.251 0.502 100.4 茶油1-add10-1 353757 5.257 10.514 105.1 584509 5.377 10.754 107.5 130638 5.466 10.932 109.3 333195 5.419 10.838 108.4 茶油1-add10-2 336365 4.998 9.996 100.0 549530 5.055 10.11 101.1 123467 5.166 10.332 103.3 311608 5.068 10.136 101.4 茶油2 0 0 0 / 0 0 0 0 0 0 0 0 0 / 茶油2-add0.5 14848 0.221 0.442 88.4 28138 0.259 0.518 103.6 5656 0.237 0.474 94.8 14193 0.231 0.462 92.4 茶油2-add10-1 341035 5.067 10.134 101.3 561527 5.166 10.332 103.3 124928 5.227 10.454 104.5 319881 5.202 10.404 104.0 茶油2-add10-2 339856 5.05 10.1 101.0 558025 5.133 10.266 102.7 124545 5.211 10.422 104.2 317236 5.159 10.318 103.2 两种茶油样品液相检测峰面积、浓度、回收率数据汇总 3结论 此所建立的高效液相色谱-柱后光化学衍生法测定油茶中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法，用甲醇水提取茶油中的黄曲霉毒素，经PriboFast@黄曲霉素总量免疫亲和柱净化和富集，在高效液相色谱串联 Pribolab@ KRC 光化学柱后衍生器检测下，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检出限可达 0.05 n g/kg、0.03 ug/kg、0.1ng/kg、0.04ng/kg， 满足《GB2761-2017-真菌毒素限量》要求。 目的建立高效液相色谱-柱后光化学衍生法测定油茶中黄曲霉毒素含量的方法。检测方法，以市售油茶油为样品,经80%甲醇水溶液提取、离心,吸取上清液稀释,专用免疫亲和柱净化后,采用高效液相色谱仪带荧光检测器串联柱后光化学衍生器测定黄曲霉毒素。同时,对样品提取条件的选择、样品净化过程、流动性比例选择等进行优化实验研究。结果黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2在0.5～50 ng/mL范围内线性关系良好,相关系数r2＞0.9999,在0.5μg/kg（检出限）、10μg/kg（限量）添加水平下的回收率为88.4%～104.5%,相对标准偏差0.3%～6%。结论该方法简单、准确、重现性好,适用于油茶中黄曲霉毒素的定量分析。黄曲霉毒素是迄今发现的毒性最大的真菌毒素，是世界公认的3大强致癌物质之一。黄曲霉毒素主要污染粮油制品，易在玉米、稻谷、花生、桃仁、果仁、坚果等油脂含量较高的粮食作物上生长。我国国家标准GB 2761—2017规定食用油中黄曲霉毒素B1的限量标准不得高于10μg/kg。目前针对植物油中黄曲霉毒素的检测主要依据食品中黄曲霉毒素的检测方法如：高效液相色谱法、同位素稀释液相色谱-串联质谱法、酶联免疫法，茶油中黄曲霉的检测相关文件少之又少。本研究基于HPLC-柱后光衍生的基础上结合免疫亲和浓缩富集，建立一种准确、高效的测定和确证茶油中黄曲霉毒素的方法。1 实验部分1.1 试验材料尚野山茶油（油茶籽油-安徽尚野茶油有限公司）；纯正茶油（油茶籽油-浙江久晟茶油科技股份有限公司）1.2 仪器与试剂高效液相色谱法-带荧光检测器（岛津）；光化学柱后衍生器（Pribolab® KRC光化学柱后衍生器）；超声波清洗装置；涡旋仪；分析天平；固相萃取装置（Pribolab® 8位泵流操作架）；黄曲霉毒素免疫亲和柱（PriboFast®黄曲霉素总量免疫亲和柱3ml）。甲醇（色谱纯）；Pribolab® PBS缓冲液；高纯水；黄曲霉毒素标准品（Pribolab®25µg/mL黄曲霉毒素(Aflatoxin)B1,G1,B2,G2/甲醇）。1.3 实验方法1.3.1 试样处理 准确称取5.00g油样于 50mL 离心管中，加1.0g氯化钠；加 25mL70%甲醇水，涡旋混匀，置于超声波或涡旋振荡器中振荡 30min ；过玻纤滤纸，取5mL滤液，加20mL PBS溶液稀释混匀，备用。冷藏条件下储存的黄曲霉毒素免疫亲和柱取出后恢复至室温，移取上述提取液全部重力过柱，分别用10mL PBS和10mL一级水加压清洗，弃去全部流出液，并使 2~3mL 空气通过柱体；以2.0mL 色谱级甲醇分两步进行洗脱，重力洗脱。最后轻微加压排净洗脱液，0.22μm 滤膜过滤，待测。1.3.2 分析条件 色谱柱：PRIBOLAB ODS C18液相色谱柱（5μm，4.6mm×150mm）；流动相：甲醇：水=45：55，等度洗脱；流速1mL/min；进样量：20μL；激发波长:360nm；发射波长:440nm。 2 结果与结论2.1样品前处理 比较甲醇、乙腈、正己烷后，得出70%甲醇水提取效果较好，溶剂中油脂含量明显较低，回收率可达85%以上；由于茶叶基质复杂，在过柱净化时，使用0.5%吐温-PBS稀释后上样，可有效减少色素等杂质在柱体上的吸附，上样完毕后，继续用PBS溶液进行淋洗，淋洗体积可视样品情况而定，一般需要10mL。如果排出的淋洗液中还有颜色，可适当增加淋洗液体积。最后用水再淋洗，以减少表面活性剂对仪器的不良影响。2.2 仪器条件 流动相选择甲醇：水=45：55，使用150mm的C18色谱柱，可以在20分钟出AFTG2、G1、B2、B1四个峰，串联Pribolab® KRC光化学柱后衍生器增强AFTG1、B1的荧光强度，响应高，峰型好。2.3 工作曲线和最小检出限 准确吸取40μL 25μg/mL的黄曲霉毒素标准溶液，用甲醇定容至1mL，制得1μg/mL的储备液，逐级稀释成0.5,1,5,10,50μg/L的标准系列溶液，按浓度由低到高的顺序进样，选定的色谱条件下测定，横坐标为浓度，纵坐标为峰面积，进行线性回归计算。结果表明黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2在0.5～50 ng/mL范围内线性关系良好,相关系数r2＞0.9999。计算3倍信噪比时所对应的样品浓度，得到的方法检出限为0.05μg/kg、0.03μg/kg、0.1μg/kg、0.04μg/kg。黄曲霉毒素G2 G1 B2 B1标准曲线、回归方程、相关系数1μg/L 与 茶油样品0.5μg/L添加的液相谱图2.4 精确度与回收率两种茶油样品，分别做了0.5μg/kg（检出限）、10μg/kg（限量）的添加，10μg/kg的样品都做了平行实验。方法的回收率为88.4%～104.5%,相对标准偏差为0.3%～6%。两种茶油样品液相检测峰面积、浓度、回收率数据汇总3 结论此所建立的高效液相色谱-柱后光化学衍生法测定油茶中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法，用甲醇水提取茶油中的黄曲霉毒素，经PriboFast®黄曲霉素总量免疫亲和柱净化和富集，在高效液相色谱串联Pribolab® KRC光化学柱后衍生器检测下，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检出限可达0.05μg/kg、0.03μg/kg、0.1μg/kg、0.04μg/kg，满足《GB2761-2017-真菌毒素限量》要求。