忍冬花中颜色与气味变化检测方案(离子迁移谱仪)

2019年6月第41卷第6期June 2019Vol.41 No.6中成药Chinese Traditional Patent Medicine 2019年6月第41卷第6期中成药Chinese Traditional Patent MedicineJune 2019Vol.41 No.6 不同发育期忍冬花颜色与气味变化 马云， 王尧尧， 管明瑞， 张玉， 石晓晨， 席晓志 ， 张芳， 李佳， 张永清*(山东中医药大学，山东济南250355) 摘要：：目的研究忍冬Lonicera japonica Thunb. 花不同发育期颜色、气味的变化。方法 采用色差仪测定不同发育期忍冬花蕾或花颜色，通过气相离子迁移谱测定气味。结果 不同生长发育期的忍冬花蕾或花的L*值(亮度)呈现先升高后降低的趋势， a值值(红绿色度)逐步升高，但二白期和金花期均有稍下降趋势；b*值(黄蓝色度)除金花期稍有下降外，整个生长发育期均稳步增大；BI值(褐变指数))逐渐升高，金花期稍有下降；忍冬花蕾或花在发育过程中，挥发性成分有的增加、有的降低、有的从有到无、有的从无到有。结论该方法稳定可靠，可作为药材成熟度的鉴定指标。 关键词：忍冬；花；颜色；气味；；气气相离子迁移谱 中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：1001-1528(2019)06-1349-05 doi： 10.3969/j.issn.1001-1528.2019.06.030 Changes of the color and odor of the flowers from Lonicera japonica indifferent development MA Yun， WANG Yao-yao ， GUAN Ming-ui， ZHANG Yu， SHI Xiao-chen， XI Xiao-zhi，ZHANG Fang， LI Jia， ZHANG Yong-qing ( Shandong University of Chinese Medicine ， Jinan 250355 ， China) 忍冬 Lonicera japonica Thunb. 为忍冬科多年生木质藤本植物，可药用部位多，具有及其重要的药用价值，其干燥花蕾或带初开的花即是著名的常用中药金银花。金银花主要药理作用包括抗菌、抗炎、抗病毒12-41等，临床多用于呼吸道感染、口腔溃疡、感冒发烧、高血脂等疾病51，年需求量在2000万公斤以上，属常用大宗中药材。金银花是药食同源的药材，在医药、食品、饮品、保健品、化妆品等多个领域被广泛应用。忍冬花于每年3、4月份开始孕育，5份开始采收，历时接近60d，整个花期分为花芽分化、花蕾发育、花朵开放及花朵凋落几个阶段。2015年版《中国药典》规定金银花为忍冬科植物忍冬 L. japonica 的干燥花蕾或带初开的花；但是实际生产过程中由于采收方法、开放花时间等因素的限制，市场上流通的 金银花药材并不全为忍冬干燥花蕾或带初开的花。自古以来，颜色、气味是传统中药材质量评价的重要指标，一些现代研究16-81也表明，颜色、气味与药材活性成分含有量息息相关。因此，本项目考虑通过系统研究忍冬花发育期间颜色、气味的动态变化，用于确定忍冬花蕾发育期(成熟度)、保证金银花药材质量，对促进金银花药材的合理开发利用，对推动中医药产业健康、快速、可持续地发展具有深远意义。 1材料 Mettler Toledo LE204E 型、01193-YP601N型电子分析天平(广州市授科仪器科技有限公司)；GLF-04 型密封型手提式粉碎机(江阴市康和机械制造有限公司)； BAG-9246A 型电热鼓风干燥箱(上海市齐欣科学仪器有限公司)； KQ-500DE 型数 ( 基金项目：国家中药标准化项目(ZYBZH - Y-SD-32)；山东省重点研发计划(2016CYJS08A01)； ； 山东省自主创新专项 (2016GSF202001) ) ( 作者简介：马 云 (1 9 93一)，女，硕士生，研究方向为中药资源及其质量控制。 E-mail： mayun144152@ 126.com ) ( * 通 信作者：张永清(1962一)，教授，博士生导师，从事中药资源及其质量控制研究。E-mail： zyq622003@126.com ) 控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；WF30 精密色差仪(深圳微福光电科技有限公司)；FlavourSpec气相离子迁移谱联用仪(食品风味分析与质量控制系统，济南海能仪器股份有限公司)。 在山东天华制药有限公司于山东省平邑县郑城镇建立的金银花规范化种植基地，选择5年生金银花植株进行采样。经山东中医药大学张永清教授鉴定，确认采样植株为忍冬科多年生木质藤本植物忍冬 Lonicera japonica Thunb. 品种系大毛花。2017年5月上旬，在种植基地随机选定 100个忍冬植株，根据发育程度将忍冬花的发育分为米蕾期、三青期、二白期、大白期、银花期、金花期等6个不同时期，见表1。每株分别采集各发育期花蕾或花100个，然后将100株上各时期花蕾或花分别置于板筛内晒干，置硅胶干燥器中备用。 表1 样品信息 Tab.1 Information of samples 发育期 批号 发育期 批号 米蕾期 17051901 大白期 17051904 三青期 17051902 银花期 17051905 二白期 17051903 金花期 17051906 2 方法 2.1颜色测定使用精密色差仪对金银花颜色指标进行测量并记录。测量条件为光源 D65；标准观察角度是10；照明口径径50 mm；扫描速度600 nm/min；波长扫描范围780~380 nm。用色空间法表示数据I，L*值为明亮度，L*越大越亮，越小越暗；a*值为红绿色度，a 值越大越偏红，越小越偏绿；； b*值为黄蓝色度， b*值越大越偏蓝，越小越偏黄色。见图1，并通过计算得出褐变系数(BI)[10-41]。取不同生长发育期忍冬花样品，粉碎，过40目筛，取适量粉末放入色差仪粉末测试盒进行测量，每个样品平行测定10次。 2.22气味测定精密称取忍冬花样品粉末0.5g，置于20 mL顶空进样瓶中；45℃、500 r/min 下孵化10 min，顶空进样；进样针温度85℃；进样体积500pL。5%苯基-甲基聚硅氧烷柱(15mx0.53 mm，0.55um)；柱温40℃；分析时间30 min；载气，高纯N；体积流量初始5mL/min，保持2 min 后， 18 min 内升至 150 mL/min ， 保持10 min。 IMS 温度45℃。所得样品的气相离子迁移谱图见图2. 2.3 数据处理采用Excel、Origin 9.0 对实验数 注：a”值正值表示红，负值表示绿； b* 值正值表示蓝，负值表示黄 图1 色空间法示意图 Fig.1 Schematic diagram of color space method 注：纵坐标代表气相色谱的保留时间，横坐标代表离子迁移时间；横坐标1.000处红色竖线为 RIP峰(反应离子峰，经归一化处理)； RIP 峰两侧的每1个点代表1种挥发性有机物；颜色代表物质的浓度，白色表示浓度较低，颜色越深表示浓度越大 图2 样品气相离子迁移谱图 Fig.2 GC-IMS chromatograms of sample 据进行分析。使用气相离子迁移谱联用仪控制系统进行忍冬花各发育期图谱的统计学分析，包括相似度检验、样品差异分析、动态主成分分析、挥发性有机物定性分析等。主成分分析121是1种统计技术，用于通过将多个变量转化为少量综合变量来简化1个复杂问题，同时损失很少的信息。 3结果与分析 3.1 颜色指标变化图3表明，不同发育期的忍冬花蕾或花的L*值呈现先升高后降低的趋势，大白期最高，为72.86；；a值随忍冬花蕾的生长发育，其整体趋势是逐步升高，但二白期和金花期均有稍下降趋势，表明这2个时期，花蕾往绿度值方向变化了微量；b值除金花期稍有下降外，整个生长发育期均稳步增大；BI值随忍冬花蕾或花的生长发育逐渐升高，金花期稍有下降。 3.2气味指标变化 3.2.1 相似度分析 对各发育时期忍冬花蕾或花样品气相离子迁移谱图进行相似度检验得出，同一 图3 各发育时期花颜色指标 Fig.33Color indicator of flower samples at variousdevelopment 样品相似度达95%，见图4A，不同样品间相似度仅56%，见图4B， 表明气相离子迁移谱气味测定试验的可信度及重复率极高。 3.2.2 样本间差异分析不同发育期的忍冬花蕾或花的挥发性物质之间存在种类和浓度上的差异，而3个相同发育期的忍冬花蕾或花平行样之间相似度良好，见图5A。为了进一步观察，可选取一张谱图作为参比，所有谱图扣减这张谱图，扣减后的谱图中，背景越干净，表示和参比的相似度越好。图 5B 中以17051906-2(金花期)作为参比，同样可以看出不同发育期的忍冬花蕾或花之间差异很大，而相同发育期样品的3个平行图谱之间相似度 图4 各样品相似度 Fig.4 Similarities of various samples 注：从左到右依次为17051903-1、17951906-1、17951906-2、17951906-3，分别属于二白期、金花期 图5不同发育期忍冬花蕾或花气相离子迁移谱图差异分析 Fig. 5 Difference analysis of GC-IMS of flower samples at various developments 3.2.3样本总体差异分析首先在谱图上选取信号峰，见图6，将关注的峰标记起来(下图仅为示例，选取的峰越多，越能真实反映样品信息)；其次，选择需要对比的6个发育期样品图谱，系统将 自动生成指纹图谱，见图7.表明每种样品的完整挥发物信息以及样品之间挥发性有机物的差异及变化；一些酯类成分(2-甲基丁酸丁酯、异戊酸、异戊醛) 随忍冬花成熟度的增加，逐渐增多，部分成分从无到有；异丁醇、乙酸丁酯等物质随忍 图6 气相离子迁移谱图谱标记示例 冬花成熟度增加而逐渐降低；另有2-己烯-1-醇和叶醇等物质随着成熟度的增加，浓度逐渐升高又降低。 3.2.4 动态主成分分析不同发育期忍冬花气味数据经动态主成分分析，见图8，表明米蕾期和三青期(1~2号)比较接近，可聚为一类，三青期、二白期、大白期、银花期、金花期(3~6号)可以很好的分开。 3.2.5 挥发性有机物定性 将通过气相离子迁移谱测得的气味数据与系统数据库比对，得到确定的21种成分，结果见图9、表2。 4 讨论与小结 由““辨状论质”3]理论可得，颜色是判断忍冬花药材等级的重要依据[14-15]，表明药材颜色与其活性成分含有量是存在密切关系的。不同发育期 Fig. 6 GC-IMS labeling example 注：图中每一列代表同一挥发性有机物在不同发育期样品中的信号峰，每一行代表一个金银花样品中选取的全部信号峰图7 各发育期样品总体气相离子迁移谱指纹图谱 Fig.77GC-IMS fingerprints of samples at various developments 注：1~6分别为米蕾期、三青期、二白期、大白期、银花期、金花期 图8 各发育期样品总体气相离子迁移谱主成分分析 Fig.8 PCA analysis of total GC-IMS of samples at va-rious developments 忍冬花蕾或花的颜色指标中，a*值与多种活性成分呈显著相关，表明花蕾颜色越绿，活性成分含有量越高，根据药材颜色判断活性成分含有量是有据可依的。 现阶段，气相离子迁移谱多应用于食品方面16]，如猪肉、羊肉、香烟、水果、葡萄酒等食品的风味鉴别；本研究将其用于测定不同发育期忍冬花蕾或花的气味，发现相同发育期样品的气味相 图9 样品气相离子迁移谱图成分定位、编号 Fig. 9 GC-IMS component localization ， numbering 似度极高，不同发育期样品的气味数据存在可分辨差异，相似度、差异检验等分析均证明此方法可对忍冬花药材气味进行分析量化；此外，不同发育期的忍冬花蕾或花挥发性物质存在很大差异，部分成分从有到无，部分成分从无到有，部分成分先增加后降低。但是由于此技术在中药材方面应用较少，系统数据库有待进一步补充，不能对所有可测得的成分进行定性定量分析。 本研究对不同发育期忍冬花蕾或花的颜色、气 表2气相离子迁移谱测得挥发性有机物 Tab.2Determination of volatile organic compounds by GC-IMS 序号 编号 成分 序号 编号 成分 1 1~2 2-一烯-1-醇 12 20 苯甲醛 2 3~4 巯基己醇 13 21 3-戊酮 3 5~6 异丁醇 14 22~23 丁醇 4 7 二甲基硫 15 24~25 乙酸丁酯 5 8~9 异戊酸 16 26 蘑菇醇 6 10~11 乙酸乙酯 17 27~28 2-甲基丁酸甲酯 7 12~13 乙醇 18 29~30 异戊醛 8 14 丙酮 19 31~32 叶醇 9 15~16 异丙醇 20 33 异丁酸甲酯 10 17~18 甲基乙基酮 21 34~35 己酸甲酯 11 19 23-丁二酮 味进行研究，拓展了 GC-IMS 的应用领域。建立不同发育期忍冬花蕾或花的颜色、气味的指纹信息模型库，为忍冬花及其他中药原料的品种鉴别提供依据。 ( 参考文献： ) ( [1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版一部 [S].北京：中国医药科技出版社，2015：221. ) ( [2] 石 钺 ，石任兵，陆蕴如.我国药用金银花资源、化学成分及药理研究进展[J].中国药学杂志，1999， 34(11)： 724-727. ) ( [3] 夏 伟，余永亮，杨红旗，等.金银花化学成分及药理作 用研究进展[J].安徽农业科学，2017，45(33)：1 2 6- 127，165. ) ( [4] Shi Z ， Liu Z ， Liu C， e t a l . 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