六味地黄丸中马钱苷和丹皮酚检测方案(液相色谱仪)

样品前处理方法2 3Thermo Fisher Scientific，San Jose， CA USA is ISO Certified.SCIENTIFICPart of Thermo Fisher Scientific 张艳海叶明立金燕 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词：在线固相萃取；高效液相色谱法；六味地黄丸；中药；马钱苷，丹皮酚 Key words： online-SPE， HPLC， LiuWeiDiHuangWan， TCM， Loganin，Paeonol 引言 六味地黄丸是常见OTC经典中药方剂，临床上有大蜜丸、水蜜丸、浓缩丸，胶囊等常见剂型。关于六味地黄丸药效的化学物质基础分析，文献报道较多，在2010版药典中，蜜丸和浓缩丸均有马钱苷的含量测定项，前处理过程为样品提取后，提取液经过氧化铝柱离线净化，再进样分析，采用四氢呋喃-甲醇-乙腈-0.05%磷酸作为流动相系统，前处理方法和分析过程较繁琐；其中另外一个指标性成分丹皮酚采用甲醇-水作为流动相进行测定分析，本方法利用双三元液相色谱的online-SPE技术，开发快速并且同时测定两种成分的方法，自动提供了在线富集、净化及检测的解决方案。 测试条件 仪器： Ultimate DGP 3600系列，包括带有在线脱气单元的双三元梯度泵；带有一个六通阀的柱温箱；紫外检测器。连接图见图1。 富集柱： Acclaim PAII (3pm x4.6mmx50mm)。 分析柱： AcclaimC18 (5umx4.6mm×150mm)。 柱温：35℃。 图1-1.阀1-2位相通时连接图 图1-2.阀1-6位相通时连接图 检测测长：236nmand 274nm。 进样量： 5pL。 流速： 1.0mL/min 流动相组成及流速：见表1。 梯度洗脱：见表2。 表1.流动相组成及流速 富集集(left pump) 分析泵(right pump) 流动相A 0.1%H，PO4 流动相B MeOH ACN 表2.梯度洗脱条件 时间 (min) 富集泵 (B%) 分析泵 (B%) 时间 (min) 阀 0 5 13 0 1-2 15 50 13 7.7 1-6 20 95 65 8.2 1-2 25 95 65 14.2 1-6 25.1 5 13 14.8 1-2 30 5 13 取本品水蜜丸0.7g，大蜜丸1g，浓缩丸0.4g，精密称定，置3个具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理15分钟使溶散，加热回流1h，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。取续滤液测定马钱苷的含量。 取六味地黄胶囊0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理40分钟，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。取续滤液测定马钱苷和丹皮酚的含量。 图2.标准溶液色谱图 (马钱苷浓度为26.5pg/mL，丹皮酚浓度为39pg/mL) 结果和讨论 实际样品分析 图3.六味地黄丸(大蜜丸)色谱图 图4.六味地黄丸(水丸)，胶囊和浓缩丸叠加色谱图 方法学考察 重复性实验 取大蜜丸样品溶液，在24小时内，间隔连续进样6次，每次进样5uL，马钱苷的峰面积RSD为1.15%，含量的RSD为1.13%；丹皮酚峰面积的RSD为3.47%，含量的RSD为3.45%；表明方法重复性较好。 图5.大蜜丸测定马钱苷时连续进样6次叠加色谱图 线性关系考察 按上述色谱条件，马钱苷在2.6~53pg/mL、丹皮酚在3.9~78pg/mL范围内，相关系数r分别为0.9996和0.9998。 加样回收率实验 取已知含量的大蜜丸、水蜜丸和胶囊适量，分别加入与样品含量相当的对照品，按照样品前处理方法制备样品溶液，计算马钱苷的回收率。结果表明回收率满足马钱苷的含量测定要求。 样品含量测定结果 按照前面确定样品前处理方法和分析方法测定六味地黄各个剂型中马钱苷和丹皮酚的含量。结果见表4. 讨论 专属性 本实验采用PAⅡIC18小柱作为一维净化柱，甲醇-0.1%H&PO水系统进行梯度洗脱，二维分析采用C18色谱柱，乙腈-0.1%HPO 水梯度分析。通过色谱柱和流动相系统差异，增加了分离选择性，从而确保目标成分色谱峰具有较好专属性。从目标色谱峰UV谱图的均匀性可以看出，2种目标成分测定方法的专属性较好。 可行性分析 该方法采用online-SPE即在线固相萃取方法同时测定六位地黄丸及其制剂中马钱苷和丹皮酚的含量，方法专属性好，回收率高，且整个分析过程简便、快速，大大加快了样品分析的效率，可满足现行药典对马钱苷和丹皮酚的测定要求。 ( [1] . ChP(中国药典).2010.Voll(一部)：5 9 7~598， 600~601. ) 表3.回收率测定结果 Table 3 Results of recovery 名称 待测成分 实际含量 ug 添加量pg 测得量pg 回收率% 平均值% Name Compound Actual Added Determined Recovery Average 222.4 101.1 胶囊 马钱苷 115.2 106 220.3 99.2 100.1 3757.4 98.4 97.7 丹皮酚 2222.4 1560 3737.2 97.1 847.2 848.9 96.8 马钱苷 436.8 424 97.2 97.01 水蜜丸 1649.7 97.5 97.8 丹皮酚 889.2 780 1654.4 98.1 907.8 95.0 95.1 大蜜丸 马钱苷 505 424 908.7 95.2 丹皮酚 1343.3 780 2094.4 2104.6 96.3 97.6 96.9 表4.样品中马钱苷含量测定结果(n=2) Table 4 determination results of Loganin in samples 名称 待测物 含量mg/g 药典方法测得含量 Name Compound contents mg/g Contents with Pharmacopoeia 大蜜丸 马钱苷 0.50 0.52 丹皮酚 1.33 1.37 水蜜丸 马钱苷 0.84 0.84 丹皮酚 1.71 1.83 浓缩丸 马钱苷 1.58 1.72 丹皮酚 1.85 1.96 胶囊 马钱苷 0.24 0.27 丹皮酚 4.63 4.85 thermoscientific.com C 2012 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific Inc. and itssubsidiaries. Specifications， terms and pricing are subject to change. Not all products are available in all countries. Please consult yourlocal sales representative for details. 上海 北京 免费服务热线：上海浦东新金桥路27号6号楼 北京东城区安定门东大街28号 8008105118邮编：201206 雍和大厦西楼F座7层702-715室 4006505118电话：021-68654588 邮编：100007传真：021-64457830 电话：010-84193588传专：010-88370548 专属性 本实验采用PAⅡC18小柱作为一维净化柱，甲 醇-0.1%H3PO4水系统进行梯度洗脱，二维分析采用C18 色谱柱，乙腈-0.1%H3PO4水梯度分析。通过色谱柱和流 动相系统差异，增加了分离选择性，从而确保目标成分 色谱峰具有较好专属性。从目标色谱峰UV谱图的均匀性 可以看出，2种目标成分测定方法的专属性较好。可行性分析 该方法采用online-SPE即在线固相萃取方法同时测定 六位地黄丸及其制剂中马钱苷和丹皮酚的含量，方法专 属性好，回收率高，且整个分析过程简便、快速，大大 加快了样品分析的效率，可满足现行药典对马钱苷和丹 皮酚的测定要求。