活细胞，荧光样品中荧光成像检测方案(荧光显微镜)

相机触发 LED光源实现活细胞自动多色成像方案探讨 关键词：荧光显微镜，pE-300Ultra， 序列运行，相机触发光源，多色荧光成像， PINKEL 滤片设置，活细胞培养装置。 一.背景介绍 活细胞多色显微荧光成像是在生物医学基础科研中常用的科研方法。活细胞培养荧光显微镜由于可以进行活细胞常规培养条件，例如：温度控制、湿度控制、CO2浓度控制、O2浓度控制，同时配置高速摄像头可以进行时间序列(Time-Lapse)，结合多色荧光滤片切换， LED单波长光源激发，可配备相差 (Phase Contrast)，微分干涉(DIC)，荧光等对照方式可以更加直观详细的进行细胞形态记录而受到广大科研用户的认可。近年来，倒置荧光显微镜配置活细胞培养装置的相关实验越来越普遍，目前市面上集成的荧光成像系统很多，例如：GE 公司的 DELTAVISION 活细胞成像系统， ZEISS公司的 CELL OBSERVER 系统，或其它大品牌公司的整套活细胞成像系统，价格通常20万美元以上，且维护成本高，厂家工程师上门速度通常比较慢或者收费贵，常规实验室难以负担。 活细胞多色荧光成像主要技术要求： 1..由于活细胞时间序列成像时间长，通常要24小时以上，获取细胞形态的时间序列图片进行分析。活细胞培养箱需要能够放置在显微镜载物台上实时成像。要求能够控制精确温度，湿度， CO2浓度，02浓度等细胞培养条件。 2.活细胞处于快速运动状态，进行多色荧光成像时，需要不同荧光通道进行快速切换，传统的电动荧光滤色镜转盘设计的电动显微镜通常价格昂贵，设备复杂。实验需要一种更简便且经济的解决方案。 3.活细胞荧光样品在传统的荧光光源例如汞灯或者金属卤化物光源照射下，光毒性作用导致细胞活性下降，而且在曝光时间过长容易照成荧光淬灭。 二.方案介绍 新型的 LED 光源由于其使用寿命长，发热少，发射光强恒定且重复性好，操作简单等优势成为越来越多荧光显微镜成像的选择。随着 LED 光源亮度加强和谱线增加， LED 光源代替传统的汞灯或者金属氯化物光源已经是大势所趋。LED 光源除了使用寿命长之外，还有一个最重要的优点即控制性好。 LED 光源可即时开/关，精确的强度控制。LED 光源还可以接受 TTL(晶体管-晶体管逻辑电平)信号系统控制 LED 快速波长切换，允许通过多通荧光滤片进行高速多色荧光成像，无震动无滤片偏移。基于此我们搭建的这套系统如下： 1.通过 LED 光源切换配合 PINKEL 滤片组代替荧光滤片转盘切换通道 2.通过相机BNC端口接受 TTL 信号触发 3.通过控制面板上的“Sequence Runner”模式设置 LED 在接受 TTL 信号后运行次序。 Cop pE-30Oultra 4..在 OCULAR 软件界面设置相机曝光触发光源，并且设置曝光时间。 5.在 NIB900 倒置荧光显微镜上加载镜载活细胞培养装置，通过温度控制器和气体控制器还调节培养罩里面的温度， CO2浓度，湿度，02浓度等培养条件。 由于新型 LED 光源和相关相机联用，多通荧光滤片等技术的成熟，广州科适特科学仪器有限公司作为显微镜及显微镜配套的活细胞培养装置，荧光光源，摄像头等配件的供应商。有机会搭建并且测试了一种优惠简便的解决方案。 三.测试过程 本测试过程采用了宁波永新 NEXSCOPE NIB900 倒置荧光显微镜主机，配置了 CoolLED公司的 pE-300ultra 高性能 LED 光源，通过100%侧分光口连接 Retiga R1 相机，搭配了德国 ibidi 公司的镜载活细胞培养系统进行活细胞的培养成像。 主要测试了以下两个方面： 1.通过 Retiga R1 相机通过外触发 pE-300Ultra LED 光源，在相机曝光时同步打开 LED光源，并且利用光源当中的”Sequence Runner"顺序打开相应的 LED 荧光通道，显微镜滤片采用 Chroma 公司的多通荧光滤片，进行紫外和红色荧光的快速切换成像。通过加载活细胞培养装置后，对样品进行加热，进行荧光测试。检测成像的均一性和荧光强度对比。图像均一性和荧光亮度评估。 图1MitoTracker Red 成像(25摄氏度) 图2加载活细胞装置后 MitoTracker Red 成像(37摄氏度) 图3无活细胞装置 DAPI 成像(25摄氏度) 图4加载活细胞装置后 DAPI 成像(37摄氏度) 2.通过加载活细胞培养装置后，对样品进行加热，进行明场测试。检测成像的均一性和荧光强度对比。 图5无活细胞装置明场病理片成像(25摄氏度) 图6加载活细胞装置后明场病理片成像(37摄氏度) 图7无活细胞装置明场病理片成像(25摄氏度))图8加载活细胞装置后明场病理片成像(37摄氏度) 四.分析测试结果 1. 通过 NIB900 直接连接 pE-300 系列 LED 光源可以获得良好的荧光强度和图像均一性。 2. 可以通过相机曝光触发实现光源同步开关，可以通过曝光时间控制光源打开时间，减少样品过度曝光导致的荧光淬灭。 3. 通过 LED 光源的内置 Sequence Runner 设置芯片依次曝光的顺序，实现 TTL 触发 LED光源通道切换代替传统的荧光滤片转盘切换。提高切换速度，避免震动和滤片漂移问题。 4. 镜载活细胞可以精确控制活细胞培养条件，德国 ibidi 活细胞培养装置放置在 NIB 900 显微镜上可以精确对焦，不影响明场和荧光显微成像效果。能够搭配同时使用。 五.测试配置方案 1. 倒置荧光显微镜主机： NEXSCOPE NIB900 2. 活细胞培养装置：ibidi Heating incubator(德国 ibidi) 3. 显微镜 LED光源：(CoolLED pE-300Ultra(英国 CoolLED) 4. 摄像头及软件： Photometrics Retiga R1 带 BNC 触发线， C0cular V2.0.1(加拿大Photometrics 5. PINKEL 滤片： Chroma 69401 (美国 Chroma) 6. 样品：：invitrogen FLuocells #1 BPAE cells(美国) Invitrogen) 六.总结 1.搭建的活细胞培养装置各部分整合良好，可以比较经济的方式实现顺畅的活细胞多色荧光成像。 2. 宁波永新 NEXSCOPE NIB900 具有很高的光学质量，具有 DIC， 相差，荧光多重功能，配置了三个摄像接口(100%/0；20%/80%；0：100%)。在成像均匀性，色差还原，物镜表现，主机扩展性方面表现良好，与进口显微镜同档次无明显差别，属少见的国产研究级显微镜精品。 3. 相对常规的活细胞成像系统，此方案采用新型 LED 光源，对细胞光毒性较小，适合活细胞样品的时间序列成像。 4. 相机曝光触发光源同步开关，减少非必要的荧光样品和活细胞的照射导致的光漂白和光毒性。 5. 相对于常规的活细胞成像系统，此方案通过相机曝光输出的 TTL信号切换荧光通道。无需滤片转盘切换，减少了显微镜震动和滤片漂移导致多通道叠加偏差。 6. 活细胞培养装置中温度控制是一个重要的实验参数，但是由于活细胞培养的探测器通常位于培养腔室的上壁边缘，由于室温(例如22℃)与培养箱中设定温度(例如37℃)偏差比较大，温度传导散热效应，为了保证真实培养温度精确，显微镜活细胞培养在不同的实验室环境首次使用前通常需要进行校准。 7. 配件可以单独增加或者拆卸，有利于减少实验预算，提高显微镜和配件的使用效率。 8. 此方法采用相机触发 LED 光源顺序开关 LED 通道，配合多通荧光滤片可以实现传统的系统活细胞多色荧光成像功能。并且可以获得更好的时间方便率。切换速度更快，适合活细胞样品多重荧光成像。 9. 由于缺乏活细胞样品，有些功能比如活细胞时间序列，微分干涉观察，相差成像等此次没有完成测试，等有条件后续进行。 如果对此方案感兴趣欢迎联系咨询 邮箱： info@kosterscience.com 电话：020-38102730 地址：广州市天河区体育西路9号骏汇大厦北座 14B-D 广州科适特科学仪器有限公司 关键词：荧光显微镜，pE-300Ultra, 序列运行，相机触发光源, 多色荧光成像，PINKEL滤片设置，活细胞培养装置。 一. 背景介绍 活细胞多色显微荧光成像是在生物医学基础科研中常用的科研方法。活细胞培养荧光显微镜由于可以进行活细胞常规培养条件，例如：温度控制、湿度控制、CO2 浓度控制、O2 浓度控制，同时配置高速摄像头可以进行时间序列（Time-Lapse），结合多色荧光滤片切换，LED 单波长光源激发，可配备相差（Phase Contrast），微分干涉（DIC），荧光等对照方式可以更加直观详细的进行细胞形态记录而受到广大科研用户的认可。近年来，倒置荧光显微镜配置活细胞培养装置的相关实验越来越普遍，目前市面上集成的荧光成像系统很多，例如：GE 公司的 DELTAVISION 活细胞成像系统，ZEISS公司的 CELL OBSERVER 系统，或其它大品牌公司的整套活细胞成像系统，价格通常20万美元以上，且维护成本高，厂家工程师上门速度通常比较慢或者收费贵，常规实验室难以负担。 活细胞多色荧光成像主要技术要求： 1. 由于活细胞时间序列成像时间长，通常要24小时以上，获取细胞形态的时间序列图片进行分析。活细胞培养箱需要能够放置在显微镜载物台上实时成像。要求能够控制精确温度，湿度，CO2浓度，O2浓度等细胞培养条件。2. 活细胞处于快速运动状态，进行多色荧光成像时，需要不同荧光通道进行快速切换，传统的电动荧光滤色镜转盘设计的电动显微镜通常价格昂贵，设备复杂。实验需要一种更简便且经济的解决方案。3. 活细胞荧光样品在传统的荧光光源例如汞灯或者金属卤化物光源照射下，光毒性作用导致细胞活性下降，而且在曝光时间过长容易照成荧光淬灭。   二．方案介绍 新型的LED光源由于其使用寿命长，发热少，发射光强恒定且重复性好，操作简单等优势成为越来越多荧光显微镜成像的选择。随着LED光源亮度加强和谱线增加，LED光源代替传统的汞灯或者金属氯化物光源已经是大势所趋。 LED光源除了使用寿命长之外,还有一个最重要的优点即控制性好。 LED光源可即时开/关，精确的强度控制。LED光源还可以接受TTL(晶体管-晶体管逻辑电平)信号系统控制LED快速波长切换，允许通过多通荧光滤片进行高速多色荧光成像，无震动无滤片偏移。基于此我们搭建的这套系统如下： 1. 通过LED光源切换配合PINKEL滤片组代替荧光滤片转盘切换通道 2. 通过相机BNC端口接受TTL信号触发  3. 通过控制面板上的“Sequence Runner”模式设置LED在接受TTL信号后运行次序。 4. 在OCULAR软件界面设置相机曝光触发光源，并且设置曝光时间。   5. 在NIB900倒置荧光显微镜上加载镜载活细胞培养装置， 通过温度控制器和气体控制器还调节培养罩里面的温度，CO2浓度，湿度，O2浓度等培养条件。 由于新型LED光源和相关相机联用，多通荧光滤片等技术的成熟，广州科适特科学仪器有限公司作为显微镜及显微镜配套的活细胞培养装置，荧光光源，摄像头等配件的供应商。有机会搭建并且测试了一种优惠简便的解决方案。 三．测试过程 本测试过程采用了宁波永新NEXSCOPE NIB900倒置荧光显微镜主机，配置了CoolLED公司的pE-300ultra高性能LED光源，通过100%侧分光口连接Retiga R1相机，搭配了德国ibidi公司的镜载活细胞培养系统进行活细胞的培养成像。 主要测试了以下两个方面： 1. 通过Retiga R1相机通过外触发pE-300Ultra LED光源，在相机曝光时同步打开LED光源，并且利用光源当中的”Sequence Runner”顺序打开相应的LED荧光通道，显微镜滤片采用Chroma公司的多通荧光滤片，进行紫外和红色荧光的快速切换成像。通过加载活细胞培养装置后，对样品进行加热，进行荧光测试。检测成像的均一性和荧光强度对比。图像均一性和荧光亮度评估。 图1 MitoTracker Red成像(25摄氏度)          图2 加载活细胞装置后MitoTracker Red成像(37摄氏度)  图3 无活细胞装置DAPI成像(25摄氏度)        图4 加载活细胞装置后DAPI成像(37摄氏度)  2. 通过加载活细胞培养装置后，对样品进行加热，进行明场测试。检测成像的均一性和荧光强度对比。 图5 无活细胞装置明场病理片成像(25摄氏度)  图6 加载活细胞装置后明场病理片成像(37摄氏度) 图7 无活细胞装置明场病理片成像(25摄氏度)  图8 加载活细胞装置后明场病理片成像(37摄氏度) 四．分析测试结果 1. 通过NIB900直接连接pE-300系列LED光源可以获得良好的荧光强度和图像均一性。2. 可以通过相机曝光触发实现光源同步开关，可以通过曝光时间控制光源打开时间，减少样品过度曝光导致的荧光淬灭。3. 通过LED光源的内置Sequence Runner设置芯片依次曝光的顺序，实现TTL触发LED光源通道切换代替传统的荧光滤片转盘切换。提高切换速度，避免震动和滤片漂移问题。4. 镜载活细胞可以精确控制活细胞培养条件，德国ibidi活细胞培养装置放置在NIB 900显微镜上可以精确对焦，不影响明场和荧光显微成像效果。能够搭配同时使用。 五．测试配置方案 1. 倒置荧光显微镜主机：NEXSCOPE NIB9002. 活细胞培养装置：ibidi Heating incubator(德国 ibidi)3. 显微镜LED光源：CoolLED pE-300Ultra(英国 CoolLED)4. 摄像头及软件：Photometrics Retiga R1带BNC触发线, Ocular V2.0.1(加拿大 Photometrics)5. PINKEL 滤片：Chroma 69401 （美国 Chroma）6. 样品：invitrogen FLuocells #1 BPAE cells (美国 Invitrogen) 六．总结  1. 搭建的活细胞培养装置各部分整合良好，可以比较经济的方式实现顺畅的活细胞多色荧光成像。2. 宁波永新NEXSCOPE NIB900具有很高的光学质量，具有DIC，相差，荧光多重功能，配置了三个摄像接口（100%/0；20%/80%;0:100%）。在成像均匀性，色差还原，物镜表现，主机扩展性方面表现良好，与进口显微镜同档次无明显差别，属少见的国产研究级显微镜精品。3. 相对常规的活细胞成像系统，此方案采用新型LED光源，对细胞光毒性较小，适合活细胞样品的时间序列成像。4. 相机曝光触发光源同步开关，减少非必要的荧光样品和活细胞的照射导致的光漂白和光毒性。5. 相对于常规的活细胞成像系统，此方案通过相机曝光输出的TTL信号切换荧光通道。无需滤片转盘切换，减少了显微镜震动和滤片漂移导致多通道叠加偏差。6. 活细胞培养装置中温度控制是一个重要的实验参数，但是由于活细胞培养的探测器通常位于培养腔室的上壁边缘，由于室温（例如 22℃）与培养箱中设定温度（例如 37℃）偏差比较大，温度传导散热效应，为了保证真实培养温度精确，显微镜活细胞培养在不同的实验室环境首次使用前通常需要进行校准。7. 配件可以单独增加或者拆卸，有利于减少实验预算，提高显微镜和配件的使用效率。8. 此方法采用相机触发LED光源顺序开关LED通道，配合多通荧光滤片可以实现传统的系统活细胞多色荧光成像功能。并且可以获得更好的时间方便率。切换速度更快，适合活细胞样品多重荧光成像。9. 由于缺乏活细胞样品，有些功能比如活细胞时间序列，微分干涉观察，相差成像等此次没有完成测试，等有条件后续进行。