盐中寡核苷酸检测方案(液相色谱仪)

thermoscientific s4 在线脱盐高通量液质联用分析寡核苷酸 杨艳1，程汉兴1，刘晓达1，金燕^* 赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 关键词：在线脱盐，高通量，寡核苷酸，液质联用 自动进样器： Split Sampler FT(P/NVF-A10-A)柱温箱： Column Compartment H (VH-C10-A) 寡核苷酸是一类短链核苷酸的总称(包括脱氧核糖核酸及核糖核酸)，如用于基因扩增和基因诊断的PCR 引物和反义核酸，介导基因沉默的小干扰 RNA ( small interfering RNA， siRNA)等，努力研究开发基因靶向治疗药物用于治疗病毒、肿瘤和遗传疾病。天然的寡核苷酸在体内容易降解，稳定性差。通过修饰的寡核苷酸具有较好的药学特性和体内稳定性1-2，但合成的寡核苷酸产物含有各种杂质，需纯化精制，产物的鉴定和产品的质量控制至关重要。 ·质谱仪：： Thermo ScientificM LTQ-XL 质谱 ( ·分 流器：Ana l ytical S ci e nti fi c I nst r ume n ts (M o d el N o. 60 0- PO 1 0 - 06 ) ) ·色谱柱： Acclaim Polar Advantage lI 液相和液质联用于寡核苷酸目标产物的高分辨分离和鉴定， 可以判断待测寡核苷酸结构的变化，比如脱嘌呤、氧化、磷酸化等。寡核苷酸样品中存在的盐分会影响其离子化过程和造成峰强度降低，因此有必要进行质谱鉴定前的除盐处理。常规离线除盐方法耗时；可以利用在线除盐方式进行寡核苷酸的分离鉴定，但样品通量需要提高，以满足高通量的要求，如平均每天2000个样品的需求等。 2.试剂 甲醇(质谱级， Fisher公司)、三乙胺( Sigma )、六氟异丙醇( Sigma)，去离子水(18.2MQ) 3.样品 合成的不同分子量的寡核苷酸含盐的样品来源于客户。 本工作中，我们利用阀切换技术I3-5]对寡核苷酸样品进行在线除盐，建立简单、快速、高效的超高效液相色谱线性离子阱质谱仪(Vanquish Duo-LTQ XL)在线除盐和寡核苷酸分子量测定的分析方法。 4.色谱条件和质谱条件 色谱柱：Acclaim Polar Advantage lI ( C18-2x10 mm 5 pm) 柱温：30℃ 1.仪器和耗材 。包括下列模块和组件的 Thermo Vanquish Duo 超高效液相色谱系统 Vanquish Duo 右泵(平衡泵)流动相A： 0.75%六氟异丙醇和0.038%的三乙胺的水溶液Vanquish Duo 左泵(分析泵)流动相B：0.75%六氟异丙醇和0.038%的三乙胺和90%甲醇溶液 泵： Dual Pump ( P/N VF-P32-A) 色谱方法见表1和表2，质谱条件见表3。 实验结果与讨论 时间(min) 流速(mL/min) %A 0 2 100% 0.5 2 100% 1.色谱柱串联在线除盐旧 表1.右泵流路色谱方法 利用图1的串联配置可以加速脱盐和洗脱过程。在线除盐和分析的整个过程主要分为两个部分： (1)样品上样至脱盐柱1，在流速2mL/min 的除盐水相条件下，样品中的盐快速被除去，待测样品保留在脱盐柱上； (2)进行阀切换，洗脱有机相快速进入脱盐柱1，将待测样品从脱盐柱1上洗脱进入质谱检测。 时间 (min) 流速(mL/min) %B 0 1.5 100% 0.5 1.5 100% 2.Vanquish Duo 串联 MS (LTQ XL) 进行寡核苷酸定性分析 表2.左泵流路色谱方法 图3-5所示，为寡核苷酸样品S1和S2的质谱总离子流谱图，响应良好，测得质谱原始数据须保存为 Profile 格式，通过BioPharmaFinder 软件 Intact 分析进行去卷积分析，得到相应的寡聚核苷酸样品分子量(图6-8)和去卷积后匹配原始谱图(图9-11) 离子源参数 Sheath Gas Flow Rate 40 Aux Gas Flow Rate 10 Sweep Gas Flow Rate 0 Spray Voltage -3.5kv Capillary Temp 360 Capillary Voltage -20 Tube Lens -40 采集模式 负离子模式 扫描范围 50-2000 SID 30ev 5s4 图3.S1寡核苷酸样品质谱总离子流谱图(TIC) NL：1.40E7 S10 表3.质谱条件 图4.S2寡核苷酸样品质谱总离子流谱图(TIC) NL：1.06E7 脱盐柱1：上样和脱盐 脱盐柱1分析和脱盐柱2平衡 图5.S3寡核苷酸样品质谱总离子流谱图(TIC) 图1.快速除盐的串联管路连接图(U代表上阀，L代表下阀) 图6.S1寡核苷酸样品去卷积后分子量 图7.S2寡核苷酸样品去卷积后分子量 s6 图8.S3 寡核苷酸样品去卷积后分子量 s4#3-16 RT：0.063-0.435 AV：14 图9.S1寡核苷酸样品匹配原始质谱图 s10 #3-16 RT：0.063-0.435 AV：14 F：ITMS-p ESI Full ms [400.00-2000.00] 图10. S2寡核苷酸样品原始质谱图 s6 #3-16 RT：0.063-0.435 AV：14 图11.S3寡核苷酸样品原始质谱图 样品 理论分子量 实测分子量 差异 delta mass (Da) (Da) (Da) S1 29331.07 29333.57 2.50 S2 23010.91 23012.78 1.87 S3 26103.9 26106.29 2.39 表4.实际测得分子量和理论分子量差异 结论 本文建立了简单、快速、高效的液相色谱-线性离子阱质谱仪(Vanquish Duo-LTQ XL ) 在线除盐和检测寡核苷酸分子量的分析方法。该方法一个样品的整个分析周期为42秒(包括进样针清洗、进样和质谱数据采集)，利用该方法对不同分子量的寡核苷酸样品进行快速除盐分析，测定分子量与理论分子量平均偏差约100 ppm(表4)。建立的在线除盐方法快速简便，质谱鉴定准确度高，样品分析周期非常短(42秒)，24h内可以分析高达2000个样品，满足寡核苷酸样品的高通量分析要求。 thermoscientific ( 1.贾巧云、邓新秀、 高 婵等.反相 离子 对 高 效液相色 谱 法分析硫代反义寡 核苷 酸 C T 10 2 相关杂质。药物分析杂质2 0 13，33(7)：1 1 5 7 - 1 162 ) ( 2. M a rti n Gi lar.，e t a l .C h ar ac teri z at io n o f ther a pe uti c olig o nu c leot i des u si n gli q uid c h r o m a t ogr a ph y w i t h o n -line m a ss spectr o m e try d e te c tio n[ J] . O ligom uc le otid e s ， 2003 ，1 3： 2 29 - 2 4 3 ) ( 3 . 1.O p i t e ck G J ， L ewis K C ， J o r gen s o n J W ， e t a l . C om pr ehe n s i ve o n -lin e L C /L C/ MS of protei n s[J]. A nal yt ic a l C hem is try ， 19 9 7 ， 69 ( 8)： 15 18- 1 5 2 4 . ) ( 4 . 2.We i J ， Sun J， Yu W ， e t a l. G lo bal Prot e ome Di s covery U s ing a n O n l i n e Thr ee- Dim en s iona l L C -MS/M S [J ]. J o ur nal of P r o t eo m e Re s earc h， 2 0 0 5 ， 4( 4)： 8 0 1 -8 0 8 . ) ( 5 . 3 . Yo s h ida H ， M i zu k o shi T ， H ir ayam a K， e t al. O n - li n e d e s al ti n g-mas s spe ctrome t r y s y ste m f o r th e s t r uctura l determin at i o n of h yd r op h ilic m e ta bo li te s ， u si ng a co lumn sw i t chi n g t echni q ue a n d a vola t i le i o n - p a i ring r e ag ent.[ J] . J o u rnal of C hrom a t o g raphy A ， 2 0 06， 11 19 (1)：31 5- 321. ) ( 6. o n- l ine hi g h-t h ro ughp ut desa lt in g t o pr e p a r e sa m pl es f or ma sssp e ct r ome t ry. a ppl ica t ion u pdate 1 74 ) Thermo FisherSCIENTIFIC 热线：话：ww.thermofisher.comSCIENTIFIC 本文建立了简单、快速、高效的液相色谱 - 线性离子阱质谱仪 （Vanquish Duo-LTQ XL）在线除盐和检测寡核苷酸分子量的分析 方法。该方法一个样品的整个分析周期为 42 秒（包括进样针清洗、 进样和质谱数据采集），利用该方法对不同分子量的寡核苷酸样品 进行快速除盐分析，测定分子量与理论分子量平均偏差约 100 ppm （表 4）。建立的在线除盐方法快速简便，质谱鉴定准确度高，样 品分析周期非常短（42 秒），24h 内可以分析高达 2000 个样品， 满足寡核苷酸样品的高通量分析要求。