白酒中痕量甜味剂检测方案(液质联用仪)

热线8008105118电话400 6505118www.thermofisher.com thermoscientific APPLICATION NOTE 21652 超高效液相三重四极杆串联质谱TSQQuantis直接进样分析白酒中痕量甜味剂 作者郭藤赛默飞世尔科技(中国)有限公司 摘要： 关键词： 三重四极杆质谱TSQ Quantis；甜 味剂；酒；TraceFinder 本文建立了超高效液相三重四极杆串联质谱直接进样分析白酒中痕量甜味剂的方法。样品不经净化，通过优化整体分析方案，并结合Thermo ScientificTMTSQTM Quantis三重四极杆串联质谱高灵敏度和抗基质干扰能力强等独特优势，排除了溶剂效应和基质干扰对定性和定量带来的影响。优化后的色谱条件： Thermo ScientificTM HHypersil GOLD C18色谱柱(2.1×100 mm， 1.9 um)，甲醇-水(0.01%乙酸)/(5：95，v/v)为流动相，流速0.35 mL/min， 柱温35℃。采用ESI源，扫描方式为选择反应监测(SRM)，不分时间段正负切换实时扫描。结果表明：6种甜味剂在0.1~1000ng/mL线性关系良好，R?均大于0.99；定量限6种甜味剂均为0.1 ng/mL。采用该方法对白酒、红酒、黄酒进行分析，均取得了满意的结果。该方法具有简单快速，无溶剂效应，基质干扰小，重现性好等优点，非常适用于酒类样品中痕量甜味剂的直接进样分析。 我国白酒有几千年的历史，与白兰地、威士忌、伏特加、朗姆酒和金酒并列为世界上著名的六大蒸馏酒。我国白酒之独特，不仅在于品种繁多、香型各异，而且其工艺各不相同，形成了组成复杂、口感多变的各香型类别，满足了不同的消费需求。在国标GB/T2760-2011《食品添加剂卫生标准》中，明确规定白酒中不得添加任何甜味剂。但一些白酒生产企业为迎合消费者需求， 在白酒中加入甜味剂以增加酒体甜味和回甜感，改善口感，从而赚取高额利润。因此，建立一种白酒中痕量甜味剂的快速准确检测方法对监控白酒品质具有重要意义。 目前，白酒中甜味剂的检测方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、离子色谱法等。但这些方法检测限高，且易出现假阴性结果，而企业加到白酒中的甜味剂仅需微量甚至痕量即可改善白酒的口感。2017.3.1正式实施的食品安全国家标准GB 5009.97-2016规定了食品及白酒中甜蜜素的测定方法，该标准为强制性标准，并将液质联用方法用于酒类样品中甜蜜素测定。液质联用方法测定酒中甜蜜素具有灵敏度高、选择性好等优势，可以大大降低检测限和假阴性结果的出现几率。 本方法在遵循国家标准的基础上，进一步做了整体分析方案的优化，使得酒类样品不经过复杂前处理可以直接进样分析，排除了溶剂效应和基质干扰对定性和定量带来的影响。采用选择反应监测正负切换实时扫描，甜蜜素负离子定量，正负两个定性离子，定性能力得到增强，实际样品分析结果满意，可用于酒中痕量甜味剂直接进样分析。 1.1仪器、试剂与材料 Thermo ScientificTM VanquishTMBinary Flex超高效液相色谱；Thermo ScientificTM TSQTM Quantis三重四极杆质谱，配ESI源； Hypersil GOLD C18色谱柱(2.1×100mm，1.9 um)。 6种甜味剂标准品(纯度大于98.5%， Dr. Ehren-storferGm bH)；乙腈(色谱纯， Fisher Scientific)；甲醇(色谱纯， Fisher Scientific)；乙酸(色谱纯，Fisher Scientific)；除有说明，所用水均为超纯水。 1.2实验方法 1.2.1样品处理和标准溶液的配制 甜蜜素标准品储备液浓度为1.0mg/mL，精确移取一定体积，用流动相逐级稀释成0.1~1000.0 ng/mL的标准工作溶液。样品前处理方法一：样品过膜，用超纯水稀释10倍后直接进样分析，进样量5uL。样品前处理方法二：样品过膜，直接进样分析，进样量1uL。 1.2.2仪器条件 色谱柱： Hypersil GOLD C18(2.1×100 mm，1.9um)；流 动相：甲醇-水(0.01%甲酸)/(5：95， v/v)；流速：0.35mL/min；柱温：35℃。流动相洗脱梯度见表1。 表1流动相梯度洗脱程序 时间/min A (0.01%乙酸) B(乙腈) 流速(uL/min) 0.00 95 5 350 0.50 95 5 350 2.50 10 90 350 4.20 10 90 350 4.30 95 5 350 5.50 95 5 350 质谱条件：ESI源，毛细管电压3.5 kV(+)/3.5kV(-)；雾化温度400℃；离子传输管温度300℃；鞘气：N2， 45arb；辅助气：N2，10arb；碰撞气：高纯Ar，1.5mTorr；不分时间段正负切换选择反应监测扫描，6种甜味剂的监测离子对、S-lens电压以及碰撞能等参数见表2。 表2三种甜味剂SRM参数 化合物 保留时间(min) 母离子 子离子 碰撞能 TubeLens 甜蜜素(-) 3.28 178.0 80.0*/96.1 40/35 101 甜蜜素(+) 3.28 202.0 122.0 10 60 纽甜(-) 3.59 377.2 200*/230.1/345.2 16/18/10 127 安塞蜜(-) 2.40 162.0 78.2/82.2* 31/15 63 糖精钠(-) 2.82 182.0 106.1*/42.5 18/24 98 阿斯巴甜(-) 2.97 293.1 200.0*/217.0/261.0 11/10/10 91 三氯蔗糖(-) 2.86 395 359.0*/178.0 12/18 167 注：*为定量离子 2结果与讨论 2.1质谱条件的优化 为得到最优的质谱参数，本文采用“T”三通流动注射泵连续进样方式，对6种甜味剂的质谱条件进行优化，整个过程由软件自动完成。结果表明：6种甜味剂均在负离子模式下容易电离，响应好于正模式。由于甜蜜素结构特殊性，其准分子离子峰有[M+H]+、[M-Na]两种形式。准分子离子峰为[M-Na]，m/z=178， 有两个子离子分别为 m/Z=80和m/z=96.1。正模式下响应较弱，准分子离子为[M+H]+， m/z=202，有一个子离子为m/z=122。优化的SRM参数见表2。 2.2溶剂效应 实验发现白酒中乙醇含量较高，强极性的基质直接进样分析对保留较弱的化合物有很明显的溶剂效应，主要表现为响应降低峰宽较大、峰前伸严重甚至出现肩峰。本文比较了不同进样量和稀释倍数对溶剂效应的影响。设置进样量分别为10uL、5uL、1pL分析白酒样品，结果表明进样量为10pL和5pL溶剂效应均较明显，当进样量减少至1pL时，目标物峰形尖锐、对称。分别进样白酒样品、用超纯水稀释5倍和10倍的白酒样品，进样量均为5pL，结果表明稀释10倍的样品无溶剂效应，峰形较好。TSQ Endura凭借较高的灵敏度，在减少进样量或样品稀释后，依然可以保证酒中痕量甜味剂的准确定量。 2.3仪器灵敏度、线性范围和精密度 减少进样量，稀释样品可以作为降低基质效应的手段，但对仪器灵敏度要求比较高。本文通过逐级稀释甜味剂高浓度标准品，进样分析，测试了仪器灵敏度，结果表明TSQQuantis具有出色的灵敏度表现，6种甜味剂ESI(-)模式下LOQ均为0.1ng/mL，如图1所示。 将标准储备液用流动相逐级稀释成0.05~1000.0ng/mL的标准工作溶液。以浓度为横坐标，峰面积响应值为纵坐标， 绘制标准曲线。结果表明：6种甜味剂在0.1~1000ng/mL线性关系良好，R?均大于0.99。图2为甜蜜素标准曲线。 图2甜蜜素线性标准曲线 本文连续进样3针标准溶液考察了仪器重现性，实验结果表明，6种甜味剂的RSD值均小于5%，数据重现性良好，见表3。 表3甜蜜素连续进样6针峰面积重现性 化合物 浓度ng/mL A1 A2 A3 RSD% 甜蜜素(-) 1.0 12251 12678 12348 1.8 安塞蜜(-) 1.0 4413 4058 4320 4.3 糖精钠(-) 1.0 5124 5006 4930 1.9 纽甜(-) 1.0 4570 4673 4531 1.6 阿斯巴甜(-) 1.0 4808 4207 4484 4.0% 三氯蔗糖(-) 10.0 1808 1698 1483 4.9% 2.4实际样品分析 按照本文所建立方法分析白酒、红酒、黄酒，加标量为100ppb，过膜，进样量1pL。由图3可以看出，6种甜味 剂各离子通道在扫描时间内不存在干扰峰和溶剂效应，可准确定量定性。 RT： 2.08-4.04 RT： 2.08-4.04 RT： 2.32 NL：2.00E4 RT：2.98 NL：3.77E3 AA： 79636 m/z= 81.70-82.70F：-cESI AA： 12816 SN： 828 m/z=199.50-200.50F：-cESI SRM ms2 161.96232 SN： 377 SRM ms2 293.100 [78.149-78.151. 100g 安塞蜜 [200.028-200.030. 82.203-82.205] MS ICIS 80- 217.028-217.030. sample2-100ppb-1 28-261.030] MS ICIS60- 261.0阿斯巴甜 sample2-100ppb-1 40 20- RT：3.40 1n NL： 7.14E4 RT：3.58an NL：3.15E4 AA：238489 m/z=79.60-80.60 F：-c ESI AA： 86040 SN： 3660 m/z= 199.50-200.50F：-cESI SRM ms2 178.062 SN： 2292 SRM ms2 377.212 [80.124-80.126] MS ICIS 100- [199.999-200.001， cosample2-100ppb-1 230.110-230.112.甜蜜素 c一 345.182-345.184] MS ICIS 红酒 纽甜 sample2-100ppb-1 203 RT：2.73 1 NL： 5.75E3 0- RT： 2.87 NL： 1.69E2 AA： 15138 m/z=105.60-106.60 F：-c AA： 725 白酒 黄酒 图3加标量为100 ppb的白酒、红酒、黄酒样品实际分析结果 2.5软件TraceFinder进行数据处理 本文所有数据处理工作均由TraceFinder完成。 TraceFinder应用程序为高通量定量分析提供面向工作流程的方法，用于特定的数据分析、仪器控制和方法开发等。可自动快速创建方法、加载样品、自动生成数据、手动查看和编辑结果，并完成数据查看和报告处理。TraceFinder提供改善的离子比率计算结果、并可以指定离子比率计算方式。TraceFinder应用程序能够导出.xml 和.csv格式的SRM参数，这些文件随后可导入到其它应用程序或仪器方法中。 图4 TraceFinder软件自动生成报告和样品确认结果 本文建立了TSQ Quantis三重四极杆串联质谱分析酒类样品中甜味剂的方法。借助TSQ Quantis 三重四及杆串联质谱高灵敏度和抗基质干扰等独特优势，并优化整体分析方案，样品不经净化可直接进样分析，无溶剂效应和基质干扰，灵敏度和定性准确度高。实际样品分析具有简单快速，无溶剂效应，基质干扰小，重现性好等优点。完全满足酒类样品中痕量甜味剂的快速分析要求。数据处理工作由TraceFinder完成，该软件用于特定的数据分析、仪器控制和方法开发等。可自动快速创建方法、加载样品、自动生成数据、并完成数据查看和报告处理。即可用于大规模定量，也可用于污染物和添加剂等自动快速筛查。 本文建立了TSQ Quantis三重四极杆串联质谱分析酒类样品中甜味剂的方法。借助TSQ Quantis 三重四极杆串联质谱高灵敏度和抗基质干扰等独特优势，并优化整体分析方案，样品不经净化可直接进样分析，无溶剂效应和基质干扰，灵敏度和定性准确度高。实际样品分析具有简单快速，无溶剂效应，基质干扰小，重现性好等优点。完全满足酒类样品中痕量甜味剂的快速分析要求。数据处理工作由TraceFinder完成，该软件用于特定的数据分析、仪器控制和方法开发等。可自动快速创建方法、加载样品、自动生成数据、并完成数据查看和报告处理。即可用于大规模定量，也可用于污染物和添加剂等自动快速筛查。