H1N1病毒中粒径测试检测方案(纳米粒度仪)

儒亚科技(北京)有限公司RUBOLAB北京市海淀区上地信息路1号金远见大楼B栋616室Tel：+86 106845546084763620 Fax： +86 21 644339022info@rubolab.cn CPS DC24000 UHR 型高精度纳米粒度分析仪在病毒颗粒粒径分布上的应用 以甲型流感病毒H1N1为例 摘要： 本文介绍了差速离心沉降法在病毒粒径分布(PSD)筛选中的应用。CPS DC24000UHR 所采用的差速离心沉降法对 PSD 测量方法具有高分辨率和精确性为研究甲型流感 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)病毒颗粒在不同缓冲系统中的聚集行为提供了一种重要的思路。此外，它还可用于其他胶体粒子系统的表征，如疫苗或病毒载体制剂。考虑到病毒颗粒大小和病毒聚集对基于病毒的生物制品的下游加工、配方和混合的巨大影响，我们的应用在有关工艺优化和产品质量的重要问题上具有重要的参考价值。 、综述： 病毒颗粒(VP)的聚集对病毒治疗的临床安全性和疗效有重要影响。通常，病毒颗粒的悬浮缓冲液用以定义其特性。用于实现这些特性的盐在化学和生物系统中表现出特殊的作用，这种作用又出现在称为 Hofmeister 系列(HS)的趋势中。HS效应可以影响胶体颗粒系统是普遍存在的。在本应用中，研究的是不同离子(阴离子： SO4，HPO4，CI， Br，NO3，I； 阳离子： K*， Nat， Lit， Mg²，Ca?)对细胞培养的流感病毒颗粒的影响。用离子的缓冲液对灭活和浓缩的病毒收获物进行透析，然后进行差速离心沉降以测量颗粒大小分布(病毒颗粒 A/Puerto Rico/8/34 H1N1，产生于粘附和悬浮的 Madin-Darby 犬肾细胞(MDCK))。 二、试验方法： HS缓冲液中的盐：盐的浓度为：20，60，540mM； NaCl浓度为：180，1020，1500Mm阴离子盐： Na2SO4， Na2HPO4， NaCl， NaBr， NaNO3， NaI； 阳离子盐： CaCl2， KCl， Licl， MgCl2 1、缓冲液的制备： 1.1、 Tris-HCl缓冲液：在室温条件下配制 10mM Tris-HC1缓冲液，称量 0.605gTris 以及 HS 盐溶解于 450ml 超纯水中，之后利用稀释的 HCl 将 pH调节 至 7.4最后用超纯水定容至 500ml； 1.2、 Na/PO4缓冲液：在室温条件下配制，用超纯水溶解 Tris 之后混入酸性碱性化合物(NaH2PO4和Na2HPO4)，之后利用 HCl滴定至 pH为 7.4，最后定容至 500ml； 注：以上试剂纯度为99%并且利用超纯水进行配制，缓冲液配置完成后用 0.2um 的瓶盖过滤器过滤并且保存在4°℃下在使用前升温至室温，此外缓冲液中需要加入 0.05%的NaN3抑制微生物的生长。 2、病毒定量-血凝试验 取 100um VP样品用 100uL 1x磷酸盐缓冲盐水 (1xPBS)在圆底96孔微量滴定板中连续稀释，100uL纯化的鸡红细胞添加到每个孔中，并在RT下培养2h之后，在700 nm 的波长下测量光消光度，量化血球凝集单位(HAU)[I]。 3、流感病毒颗粒制备 病毒颗粒通过 MDCK 悬浮液 (MDCKsus2)和 MDCK 细胞序列 (MDCKADH)交互培养作用产生 MDCK-derived A/Puerto Rico/8/34(A/PR， H1N1)病毒颗粒种子，通过 TCID50感染(TCID50：1.23×10°VP/ml) 3.1、A/PRsus ： MDCKsUS2： MDCKsus2 细胞的化学定义为无蛋白质和肽的 SMIF8-PGd 培养基。对于病毒感染，添加105个胰蛋白酶单位/细胞，在生物反应器中进行培养(Sartorius Stedim Biotech GmbH (德国哥廷根)的5-LCT5-SK)。使用10-4的多重感染(MOI)生产病毒，并在感染后72小时(hpi)收获病毒溶液。 MDCKsus2产生的 VP 随后被称为“A/PRsus” 注：培养基中含有：4mML-谷氨酰胺、4mM丙酮酸盐、5 g/L NaCl、3.66 g/L d-(+)-葡萄糖、2 g/LNaHCO3、0.242 g/LL-谷氨酸、10 mL/L 10% Pluronic-F68和1pL/L98%乙醇胺。 3.2、A/PRADH： MDCKADH： MDCKADH细胞培养在 GMEM-BHK21 培养基中。为了产生病毒，用1xPBS和不含 FCS 的新鲜培养基洗涤细胞三次，并添加5×105个胰蛋白酶单位/ml。VP的生产是在850平方厘米的滚筒瓶中进行的(Greiner Bio OneInternational GmbH， Frickenhausen， Germany)中进行的，使用0.5毫升的内部产生的A/PR 病毒储备，使用104的 MOI。病毒培养液收获 72hpi。 MDCKADH系统产生的 VP 随后被称为“A/PRADH”病毒培养液收获 72hpi。 MDCKADH系统产生的VP随后被称为“A/PRADH” 注：培养基中添加 1 g/Ld-(+)-葡萄糖、4 g/L NaHCO3、10%胎牛血清(FCS)、0.2%lab FMV 蛋白胨。 4、病毒培养液澄清灭活 收获的病毒溶液通过 5um 深度的过滤器过滤，然后是 0.65um 深度的过滤器再次过滤。澄清后，用最终浓度为6mM的β-丙内酯进行化学灭活。灭活过程在37℃下培养24小时后停止，并通过 0.45-um 深度过滤器过滤完成获得澄清病毒收获(CVH)。 5、切向流过滤病毒澄清溶液 利用切向流过滤将两种 CVH 浓缩到大约10° HAU/mL，浓缩后，通过0.1-pm过滤器对两种 CVH 进行过滤，并在-80℃下冷冻，以获得浓缩和过滤病毒样本(CFV)。 A/PRsus-CVH浓缩 10倍，经0.1um 过滤、匀浆、冷冻(-80℃)和解冻，得到9.6×104HAU/mL 的 A/PRsus-CFV。 A/PRADH-CVH浓缩40倍，经0.1 um 过滤、匀浆、冷冻(-80℃)和解冻，得到1.3×10HAU/mL 的 A/PRADH-CFV. 由于浓度差异较小，在随后的透析之前，高浓度A/PRADH-CFV 样品在 1xPBS中稀释为1：1.4，；浓度为10 HAU/mL。 注：切向流过滤盒(纤维素膜)：其分子量截止值 (MWCO) 为 750 kDa， 由 Sartorius Stedim BiotechGmbH(德国哥廷根)提供的 Sartocon Slice 200 Hydrosart. 通过 TFF 进行的浓缩：浓缩是在GE Healthcare Bio Sciences AB (瑞典乌普萨拉)的 AKTAcrossflowTFF 系统上进行的。 过滤器：德国达姆施塔特默克 KGaA， SLVV033RS 此外，最后的过滤步骤确保了 VP 聚集体在随后的实验过程中只是新形成的单体 VP· 6、透析过程 用移液管将 500pL CFV 样品移入纤维素透析管 (MWCO 为 14 kDa)并用500mL HS 缓冲液透析在室温下搅拌24小时，透析系数为 1：103。 7、差速离心沉降法测量粒度分布 使用 DCS 方法测量透析 CFV 样本的 PSD，仪器使用 DC 24000 UHR纳米粒度仪(最大转速24000转/分)其设置如下： 7.1、利用蔗糖制备梯度缓冲溶液(4-16%w/v)： 蔗糖缓冲溶液的浓度梯度为： Tel：+8610 6845546084763620 Fax： +86 21644339022info@rubolab.cn 16、14.5、13、11.5、10、8.5、、7、5.5和4% w/v 各1.6ml共计 14.4ml 注：为了降低十二烷在水-乳状液界面上吸附的蛋白质构象变化的风险，没有按照常规实验要求添加十二烷以防止缓冲液蒸发。 7.2、标准蔗糖缓冲溶液(GB)建立完成以后，注入加入 100pL 239 nm 标准颗粒在 HS 缓冲液中稀释1：4.25，以评估梯度质量 注：标准颗粒0.3-0.5%固体含量，聚氯乙烯(PVC)，颗粒密度 pp=1.385 g/cm3， CPS InstrumentsInc.， LA， 美国 注入该颗粒标准不仅确保了GB功能，而且通过减少梯度顶面蒸发增加了梯度寿命。 7.3、使梯度平衡10分钟，然后再次注入239nm 的校准用粒子标准(100uL 在HS 缓冲液中稀释 1：4.25)，然后注入100uL 透析 CFV 样品进行测量。每次测量后，用温水清洗离心盘的内外表面，以去除任何残留的梯度溶液，最后用纯异丙醇擦干。 8、差速离心沉降法测定梯度缓冲液和病毒颗粒密度 确定 CPS DC 24000 UHR 专有分析软件的参数：主要为了确定三个密度的参数即GB密度 PGB和VP浮力密度pvp， 或通常的颗粒浮力密度 pp 8.1、pGB 和 pvp的测定步骤：1100pL VP样品加入105 nm 颗粒标准(100uL样品中最终稀释1：8，，固体含量 5%w/w， 聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，颗粒密度pp=1.19 g/cm3， 和 239nm粒粒标准(最终稀释 1：16 100pL 样品， 0.3-0.5%w/w固体含量， PVC，颗粒密度 pp=1.385 g/cm， 在 4-16%w/v 和 8-20%w/v 蔗糖GB中测量三份VP样品。 8.2、PGB 的测量方法： PGB可根据测量的沉降时间(tstd)、已知密度(pstd)和标准颗粒的水动力直径(Dstd)通过线性回归确定。 注： pGB也可根据仪器本身的设置，通过测量规定体积 GB 的重量来确定。然而，使用所应用的方法测量DCS 设置本身中的 pGB将得到更精确的值。在设置中，标准粒子注入的流体在 GB 顶部， GB随时间的蒸发，以及预热离心盘内的 GB 粘度略有不同，这些都对 pGB 的测定有所影响。此外，探测器光束下方的GB与确定的沉降时间和导出的 pGB无关。 8.3、 pvp 的测定方法：对于 pvp 的测定，利用 4-16%w/v (PGB4-16%) 和 8-20%w/v (pGB8-20%) 蔗糖 GB， GB 密度通过线性回归根据标准颗粒的沉降时间tstd105nm 和 tstd239mm确定。然后，由105 nm 标准粒子的沉降时间 tstd105nm 和VP的沉降时间 tvp通过线性回归得到。 注：对于 pvp 的测定， 使用 105nm颗粒标准，因为它更接近 VP 尺寸和浮力密度。测定了 A/PRsus 和A/PRADH在1xPBS制成的 GB 缓冲液中的 pVP。 三、试验结果 A：加入105和239nm标准颗粒， 利用DCS法测量病毒颗粒A/PRADH的密度 (注：105nm标准颗粒显示聚集到四聚体。通过分别注入样品和标准颗粒物来确认峰的特性。) B：用标准缓冲液 (SB， 10 mM Tris-HCl pH 7.4) 和SB (20、60、180、540、1020和1500 mM NaCl) 透析的悬浮细胞培养衍生流感病毒颗粒(A/PRsus) 的大小分布 表观流体动力颗粒直径(nm) A、B：在标准缓冲溶液中加入20mL HS阳离子和阴离子病毒颗粒A/PRsus的粒径分布； 表观流体动力颗粒直径(nm) C、D：在标准缓冲溶液中加入60mL HS阳离子和阴离子病毒颗粒A/PRsus的粒径分布； Tel：+86 106845546084763620 Fax： +86 21644339022info@rubolab.cn E、F：在标准缓冲溶液中加入60mL HS阳离子和阴离子病毒颗粒A/PRsus的粒径分布； (由于病毒颗粒浮力密度和梯度缓冲密度之间的差异很小，因此无法测量540 mM MgCl， NaSO和Nal的结果) 表观流体动力颗粒直径(nm) A、B：标准缓冲液中加入20，60，540mL CaCl的病毒颗粒A/PRsus以及A/PRADH的颗粒分布情况(标准缓冲液：SB，10 mM Tris-HCl pH 7.4) 表观流体动力颗粒直径(nm) C、D：标准缓冲液 (SB： 10mL Tris-HCl pH 7.4) 以及加入20mLNaCI的标准缓冲溶液中病毒颗粒A/PRsus和A/PRADH的分布情况 四、结论 本应用介绍了 A/PRsus 和 A/PRADH产生的甲型 H1N1流感病毒颗粒 PSD 的特异 性离子效应。实验装置采用 DCS 圆盘离心法，可用于不同 HS 缓冲液透析后病毒PSD 的测定。 两种细胞系的 VP在低盐和含 Ca²+的缓冲液中易于聚集。对于其他筛选的缓冲液，也就是说，60和540mM的所有 HS 离子以及60、180、540、1020和1500 mM 的 NaCl， 均不可见聚集。此外，首次发现HS 缓冲液对单体VP的AHD 差异的影响部分地反映了 HS的趋势。此外，与 A/PRsus 相比， A/PRADH在含有 20mm NaCl和 Ca²+的 SB 中表现出更高的聚集性。这是由于培养基的差异(无血清与含血清)还是取决于细胞系(MDCKsUS2 VS.MDCKADH)，目前尚不清楚时刻。但是，关于VP聚集体的形成对 DSP 产量和疫苗配方的影响，任何从粘附细胞到悬浮细胞的转变或培养基成分的变化都应仔细评估。 ※ 名词缩写 A/PR， A/Puerto Rico/8/1934； AHD：apparent hydrodynamic diameter maxima；表观水动力直径最大值； AUC：analytical ultracentrifugation； 分析超速离心法； CCC： critical coagulation concentration；临界混凝浓度； CFV： concentrated and filtered virus samples；浓缩和过滤病毒样本； CSC： critical stabilization concentration；临界稳定浓度； CVH： clarified virus harvests；澄清病毒获取液； DCS： differential centrifugal sedimentation；差速离心沉淀； EM： electron microscopy；电镜、电子显微镜； GB： gradient buffer；标准梯度缓冲溶液； HA： hemagglutinin/hemagglutination；血凝素/血凝； HAU： hemagglutination units；血凝单位； HS： Hofmeister series；霍夫梅斯特系列； MDCK： Madin Darby canine kidney；犬肾细胞； MWCO： molecular weight cut-off；分子量截止值； NA： neuraminidase；神经氨酸酶； PBS： phosphate buffer saline；磷酸盐缓冲盐水； PSD： particle size distribution；粒径分布； RT： room temperature；室温； SB： standard buffer；标准缓冲溶液； SPA： single particle approximation； 单粒子近似法 VP： virus particle；病毒颗粒 ( 参考文献： ) Michael ，M. P.， Anja，H.， Michael， W. W.， Udo， R.， Specific ion effects on the particle size distributionsof cell culture-derived influenza A virus particles within the Hofmeister series. Eng. Life Sci. 2016， 00， 1-9 病毒颗粒（VP）在溶液中的团聚对病毒治疗的临床安全性和治疗效果有重要影响。通常，通过观察病毒颗粒在缓冲液中的状态来评价产品性质。用于实现这些特性的盐使其在化学和生物系统中反复出现的特定效果趋势被称为霍夫迈斯特系列(HS)。霍夫迈斯特系列效应是普遍存在的，可以影响胶体粒子系统（如鸡蛋的变性，由液态鸡蛋转变为皮蛋）。其中能够影响胶体变性的离子有阴离子：SO42−、HPO42−、Cl−、Br−、NO3−、I−。阳离子：K+、Na+、Li+、Mg2+、Ca2+。