葡萄酒中砷形态检测方案(ICP-MS)

作者 Courtney Tanabel-2， Susan E.Ebeler1-2， Jenny Nelson1-3 美国加州大学戴维斯分校食品安全与测量机构 美国加州大学戴维斯分校葡萄栽培和酿酒系 安捷伦科技有限公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉市 使用LC-ICP-MS/MS 快速分析葡萄酒中的砷形态 应用简报食品和饮料 前言 砷(As)天然存在于环境中，但人类活动也会造成某些地区的砷含量增加。人为砷来源包括采矿、冶炼和发电等工业过程，以及农业农药和木材防腐剂等"。一旦发生砷污染，其在环境中可存在数十年。例如，在20世纪70年代禁止了含砷农用化学品的广泛使用，但在一些土壤中，砷酸铅和砷酸钙的含量仍然很高。土壤和水中的砷可被农作物吸收。以葡萄酒为例，砷含量也会受到酿酒过程的影响。 砷在食品和饮料中以多种形式存在，每种形式的毒性各不相同。砷的无机形式 (iAs) 包括 As(III)(亚砷酸盐)和As(V)(砷酸盐)，这些形式的毒性最高，被归类为1类致癌物质。相比之下，砷甜菜碱 (AB)是新鲜海鲜中含量最高的 As 形式，对人体基本上无毒。由于不同形态 As 毒性的极大差异 以及 iAs 潜在的健康威胁，因此很有必要测定食品中各种形态砷的含量，而不仅仅是总 As 浓度。美国食品药品监督管理局(FDA)对苹果汁中的 iAs 规定了10 pg/kg(ppb) 的行动限值，但美国目前尚未颁布布萄酒中 As含量的控制法规。加拿大(酒商质量联盟(VQA)， 安大略省)和欧洲(国际葡萄与葡萄酒组织(0IV))分别将葡萄酒中总砷的最高可接受限值规定为 100 pg/L 和200 pg/L (ppb)3.4。 食品砷污染是公众关注的焦点。因此，非常需要快速可靠的筛查方法来准确测定食品和饮料中的 iAs 含量，以满足现有和未来的法规要求。其中，最有用且可靠的一种方法是，使用高效液相色谱(HPLC) 对不同形态的砷进行分离，然后采用电用耦合等离子体质谱 (ICP-MS)进行定量分析。 本文所述的方法基于先前由 Jackson 开发的 As 形态分析方法，该方法将 HPLC 与串联四极杆 ICP-MS (ICP-MS/MS) 联用6。本研究也采用 HPLC-ICP-MS/MS。然而，与分别分析iAs 形态不同，在分析之前先用过氧化氢将 As(III) 氧化为 As(V)7.8。本方法通过转化 As(III)并以 As(V) 的形式分析所有无机形态，能够在2分钟内将一甲基胂酸(MMA)和二甲基胂酸(DMA) 与 iAs (呈As(V)形态)分离。本方法的分析时间比当前用于 As形态分析的 FDA 方法快10倍。 在本研究中，在 ICP-MS/MS碰撞/反应池 (CRC)中采用氧气作为反应气体，以解决对As的光谱干扰，同时保持出色的灵敏度。结果证明，新方法具有出色的准确性和重现性。由两个参与实验室分析同一种葡萄酒基质，对本方法进行了进一步验证。 实验部分 ( 标准品 ) As (III) 和 As (V)标准品购自 Spex Certiprep(Christiansburg， VA；Metuchen， NJ， USA)。MMA 和DMA标准品购自 Chem Service (West Chester， PA，USA)。AB标准品同样购自 Chem Service， 将其用作流动注射标记物(内标)进行柱后注射。对于 DMA、MMA 和总 iAs (As (III) 和 As (V)总和)，制备浓度为0.1、0.5、1.0、5.0、10和20 pg/L (ppb)的校准标样。 在验证(V)研究中使用五种不同的加利福尼亚葡萄酒。每种葡萄酒分别代表五种主要形式的葡萄酒之一：红葡萄酒、白葡萄酒、玫瑰红葡萄酒、起泡酒和餐后甜酒。在商品市场菜篮子(MB)研究中，对另外五种加利福尼亚葡萄酒进行了分析。表1列出了所有样品的葡萄酒类型、栽培品种、种植产地、年份和酒精含量的详细信息。 表1.用于验证和商品市场菜篮子研究的葡萄酒样品的葡萄酒类型、栽培品种、产地、年份和酒精含量 样品 类型 栽培品种 产地 年份 酒精含量(%v/v) V-1 玫瑰红葡萄酒 仙粉黛 纳帕与洛迪 不适用 9.5 V-2 白葡萄酒 白苏维浓 奥克维尔/纳帕县 2013 13.0 V-3 起泡酒 起泡白葡萄混酿 索诺马县 不适用 12.0 V-4 餐后甜酒 小西拉波特 克拉克斯堡/优洛县 2012 20.0 V-5 红葡萄酒 赤霞珠 蒙特雷县 2013 14.5 MB-1 红葡萄酒 赤霞珠 北海岸 2009 13.5 MB-2 红葡萄酒 黑比诺 中央海岸产区 2004 13.8 MB-3 白葡萄酒 莎当妮 圣巴巴拉县 2013 13.5 MB-4 玫瑰红葡 萄酒 仙粉黛 纳帕与索诺马 2013 10.5 MB-5 白葡萄酒 莎当妮 中央海岸 2013 13.5 样品前处理 以 1：1的比例将Hz0z加入所有样品中，将 As(III)氧化为 As(V)。用去离子水进一步稀释每个样品，使总稀释倍数为5或6(两个稀释倍数之间的结果没有差异)。然后使每个样品通过 0.45 um针头过滤器，以除去所有颗粒物。所有 As 形态按以下三种浓度加标至样品V-1、V-4、V-5(均为一式两份)：5、10、30ug/kg。 仪器 将配备 Hamilton PRP-X100 5 pm 50×2.1 mm 色谱柱的 Agilent 1260 HPLC 与 Agilent 8800 串联四极杆ICP-MS (ICP-MS/MS)联用。流动相为 40 mmol/L碳酸铵 ((NH4)2CO3， 痕量金属级99.999%，购自 SigmaAldrich)， 其中含3% v/v 甲醇 (Optima LC/MS 级，购自 Fisher Chemical)，并用氢氧化铵 (Optima 级，Fisher Scientific) 将 pH调节至9.0。ICP-MS/MS 配备 标准样品引入系统，该系统包括带内径 2.5 mm 中心管的石英炬管、石英雾化室、玻璃同心雾化器和镍接口锥。按照 FDA EAM $4.10和4.11.15进行峰积分。仪器操作条件汇总于表2中。 表 2. HPLC-ICP-MS/MS操作条件 ICP-MS/MS 正向功率 1550W 采样深度 8.0 mm 雾化室温度 2°C 载气 0.95 L/min 尾吹气 0.20 L/min 提取电压1 0V 八极杆偏置电压 -5.0V 动能歧视电压 -7V 池气体(02)流速 0.31 mL/min 扫描模式 MS/MS Q1/Q2 质量数 75/91 u HPLC 流动相流速 0.5mL/min 进样量 5 pL 样品温度 4°C ISTD 进样量 5uL 快速方法的开发 在本研究中，方法开发的重点在于缩短每个样品的分析时间。在本方法的开发过程中，我们参照 Jackson 的方法，使用较小的进样量、短离子交换色谱柱、氧气池气体和高流动相线速度6。 图1示出了0.5、1.0、5.0和20 pg/kg 代表性校准标样组的重叠色谱图。所有As 形态均在两分钟内得到清晰分离。只需将 As(III) 氧化为 As(V) 并以 As(V)的形式分析所有 iAs，即可相对当前的 FDA法规方法显著缩短分析时间。 线性校准 DMA、MMA和 iAs 的校准曲线均显示出良好的线性(图2)。除iAs外，葡萄酒样品中的所有 As 浓度均在线性范围内， iAs 是在最高浓度校准标样的150%的最大浓度下测定的。 图1.0.5、1.0、5.0和20.0 pg/kg 校准标样的叠加图。通过外部切换阀在柱后加入AB内标(流动注射标记物；第四个峰) 图2.DMA、MMA 和总 iAs (转换后的 As (III) 和 As (V)的总和)的校准曲线 检测限 表3列出了对 0.05 pg/kg (ppb) 混标进行重复测定得到的检测限(LOD)和定量限(LOQ)， n=15。 表 3.LOD (3o)、LOQ(30o) 和葡萄酒LOQ估算值 LOD(pg/kg) LOQ (pg/kg) 葡萄酒 LOQ估算值，(6倍稀释) pg/kg DMA 0.018 0.175 1.1 MMA 0.026 0.258 1.5 iAs 0.022 0.221 1.3 经英国皇家化学学会授权引用 加标回收率 将每种形态 (DMA、MMA和按 As (V) 计的总 iAs) 以5、10和30 pg/kg 的浓度对样品V-1、V-4和V-5进行加标(均为一式两份)。在三种不同的加标浓度下，所有As 形态的平均回收率为100±3%(表4)。 表4.葡萄酒V-1、V-4和V-5中三种加标浓度的 DMA、MMA 和 iAs的回收率(平均值和范围) DMA MMA iAs 平均值，% 102 97 99 范围，% 97-107 91-102 95-103 定量结果 使用全新的 HPLC-ICP-MS/MS 方法对所有10种葡萄酒进行分析。表5列出了 DMA 和 iAs 的实测浓度。所有MMA的浓度均低于计算得到的 LOD (0.026 pg/kg)，无法定量。将使用新方法得到的实测浓度与使用 FDAEAM $4.10 扩展方法110得到的值进行比较。测量结果之间的一致性大都处于±10%以内。在所有葡萄酒中，iAs 代表了大部分 As， 仅有一个葡萄酒样品(MB-3)中包含的 DMA 浓度明显高于 1.1 pg/kg 的 LOQ。 V-1的色谱图见图3。 总体来说， iAs 的浓度范围为 1.7±0.3至32.9±0.8 pg/kg(后者高于 FDA 规定的苹果汁中iAs 的行动限值10 pg/kg)。所有 As 形态的浓度之和(表5)的范围从2.2±0.3 ug/kg 的最低值到 32.9±0.8 pg/kg 的最高值，这个范围低于 100 pg/L 的加拿大限值和 200 pg/L的OIV 限值。 表5.对于五种验证(V)葡萄酒和五种市场菜篮子(MB)葡萄酒，将采用快速且“切合实际需求”的分析方法的结果(在两个不同实验室测得)与 FDA EAM S4.10扩展方法的结果进行比较。将“实测值”除以“EAM S4.10”并将“形态总和”除以“总浓度”，计算得到百分比回收率 (在括号中给出) 样品 DMA (pg/kg) iAs (pg/kg) 总砷(pg/kg) EAM $4.10 实测值 EAM S4.10 实测值 总浓度 形态总和 V-1 0.81±0.1* 0.72±0.04(89%) 14.4±1.0 16.0±0.5(111%) 16.5±0.02 16.7±0.5(101%) V-2 0.74±0.04* 0.72±0.06(98%) 10.7±0.2 11.4±0.4(107%) 12.6±0.16 12.1±0.3(96%) V-3 0.75±0.1* 0.83±0.04(111%) 9.2±0.4 9.5±0.6(103%) 10.4±0.11 10.3±0.5(99%) V-4 1.70±0.1 1.86±0.06(109%) 2.1±0.3 2.3±0.4(109%) 4.5±0.01 4.1±0.4(92%) V-5 0.45±0.01* 0.47±0.04(105%) 1.5±0.3 1.7±0.3(113%) 2.4±0.03 2.2±0.3(90%) MB-1

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