糖基化广泛存在于植物的一系列生物过程中,并被认为对人体健康有益,但是有关这一生物过程的研究有限,其主要原因在于缺乏有效的分析方法鉴定植物中丰富多样的糖基化代谢物。本应用简报介绍了 Dai 等人最近报道的一种研究茶叶 (Camellia Sinensis L.) 中糖基化过程的非靶向特异性修饰代谢组学方法。将安捷伦超高效液相色谱 (UHPLC) 与高分辨率四极杆飞行时间质谱 (Q-TOF/MS) 结合使用,在全离子源内碎裂模式下对绿茶进行分析。利用实验室定制的工作流程对采集的数据进行处理,基于特定糖基化修饰的特征性中性丢失模式,选择性地提取与糖基化相关的化合物。直接在数据库中搜索糖基化代谢物或相应的底物,进一步鉴定这些化合物。借助这一策略,同时检测出 202 种糖基化代谢物,包括葡糖基化/半乳糖基化、鼠李糖基化、芦丁糖基化和樱草糖基化,其中在绿茶浸泡液中推断鉴定出 68 种糖基化代谢物。基于 MS/MS 谱图,初步解析出另外 44 种新型糖基化代谢物。此方法使用户能够分析、发现和鉴定植物样品中的新型糖基化代谢物。所述工作流程大大拓展了糖基化代谢物的鉴定范围,并提高了对未知代谢物进行结构解析的能力。该方法可以进一步扩展以分析植物中许多其他重要的修饰。
应用简报 Agilent食品检测与农业Trusted Answers 应用代谢组学技术研究不同品质白茶的代谢物与风味特征 Meiling Lu 中国北京 本应用简报通过基于 UHPLC-Q-TOF/MS 的非靶向代谢组学分析方法探讨了白茶中非挥发性化合物对茶叶风味特征的影响。使用 UHPLC-Q-TOF/MS 分析茶叶的提取物,然后进行特征化合物的提取和比对,得到1915种化合物。基于这些化合物的主成分分析(PCA) 和有监督的偏最小二乘差异分析(PLSDA) 表明,三种不同品质白茶样品可以很好地分离。通过与标准品和数据库进行匹配,鉴定出多达99种代谢物。经由显著性检验和相关性分析发现,有显著差异的代谢物中有41种与风味高度相关;其中,茶氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和 AMP 与鲜味呈正相关,而黄烷-3-醇、聚酯型儿茶素、原花青素B3和可可碱与苦味和涩味呈正相关。结果表明,代谢组学技术是一种有效的发现茶叶中特征代谢物的手段,这些特征代谢物有望作为潜在标记物用来区分不同品质的白茶,以应对人为掺假和标签错贴的现象。 白茶 (Camellia sinensis L.) 是中国传统茶叶之一,主要产于中国福建省的北部和东部。近年来,白茶已被证明对健康具有潜在益处,因而促进了其在中国的消费。不同品质的白茶具有不同的生物活性、香气、风味和商业价值。已有文献对白茶中少数已知的高丰度物质进行了定量研究2.3。为一一步了解白茶品质,防止人为掺假和标签错贴,本应用报告介绍一种采用代谢组学方法研究不同品质白茶中的非挥发性组分,旨在阐明白茶的特征和差异代谢物及其与白茶风味((鲜味、苦味和涩味)之间的关系。 样品前处理 将新鲜茶叶按品质分类,包括10种白毫银针(SN)、8种白牡丹(WP)和11种寿眉(SM)。将这些茶叶按照典型的白茶制作工序(包括萎凋和干燥)加工为白茶。制成白茶后,将其研磨成粉末(使用100目筛网过筛),并于4℃下保存。称取每个茶粉样品1g, 加入到100 mL 沸水中,在100°℃下浸提5分钟后使用纤维素滤膜过滤,用于茶叶风味的量化评价。对于包括鲜味、苦味和涩味的茶叶风味的等效量化评价方法,参见之前研究中的详细描述4. 茶叶代谢物提取 将茶粉(每个样品0.1g) 在 10mL 去离子水(100℃)中浸提5分钟,提取茶叶代谢物。移取2mL溶液,然后以10000×g的速度将其离心10分钟。使用0.22 um膜 过滤上清液,然后进行UHPLC-Q-TOF/MS分析。将等体积的每种茶叶样品(50pL)混合,制备得到质控(QC)样品。这些质控样品用于评估代谢组学分析的数据可靠性与稳定性。图1为样品前处理示意图。 采用 UHPLC 与Q-TOF 质谱仪的联用系统进行数据采集。表1所示为 HPLC 分离和MS 检测的详细条件。使用 LC/Q-TOF 获得 TOF 扫描和自动 MS/MS数据,以及标准化合物的靶向 MS/MS 数据。 代谢组学分析工作流程 为进行非靶向代谢组学分析,首先在 TOF扫描模式下获得各组样品和QC样品的精确质量质谱图。使用 Agilent MassHunterProfinder 软件(8.0版)对得到的原始数据进行分子特征提取,并将结果导入Mass Profiler Professional (MPP)软件(14.8版,安捷伦科技公司, Santa Clara,CA),根据QC样品中各峰的变异系数(≤30%)进行峰对齐和初步过滤。通过以下方式鉴定所得峰: 与数据库(包括 Metlin 和 HMDB)进行匹配 与标准化合物进行匹配 根据 MS/MS 谱图进行解析 采用包括主成分分析、偏最小二乘差异分析和层次聚类分析的化学计量学方法,来展示有显著差异的代谢物在不同品质白茶中的表现。对鉴定出的差异代谢物的丰度与茶叶风味进行了 Pearson 相关性分析。 在三组茶叶样品中,对得到的具有高度相关性的差异代谢物进行了验证。图2所示为茶叶代谢组学分析的完整工作流程。 表1.仪器条件 参数 值 液相色谱条件 HPLC 内置脱气机的 Agilent 1290 InfinityⅡ液相色谱仪;带温控功能的自动进样器;柱温箱 色谱柱 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18,150×3.0 mm,1.8 pm 柱温 40°C 流动相 A)0.1%甲酸水溶液 B)甲醇 流速 0.4mL/min 进样量 3.0 pL 进样针反冲 使用纯甲醇冲洗5s 梯度洗脱曲线 0-4分钟 B由10%升至15% 4-7分钟 B由15%升至25% 7-9分钟 B由25%升至32% 9-16分钟 B由32%升至40% 16-22分钟 B由40%升至55% 22-28分钟 B由55%升至95% 28-30分钟 B为95% 30-31 分钟 B由95%降至10% 31-35分钟 B为10% ESI-Q-TOF MS条件 质谱仪 配备双喷射流电喷雾离子源的 Agilent 6540/6545 超高分辨率精确质量 Q-TOF LC/MS 极性 正离子模式 干燥气温度 300°C 干燥气流速 8 L/min 雾化气压力 35 psi 鞘气温度 300°℃ 鞘气流速 11L/min 毛细管电压 3500V MS 扫描范围 m/z 100-1100 MS/MS 扫描范围 m/z 50-1100 参比离子 m/z 121.0509/922.0098 扫描模式 TOF扫描、自动 MS/MS和靶向 MS/MS 茶叶提取物的分离与检测 如之前的报道所述,使用优化的 UHPLC梯度洗脱可以分离白茶提取物中的数千种化合物。将色谱柱洗脱液通过电喷雾离子源接口引入到 Q-TOF MS 质谱仪中,在TOF 扫描模式下进行检测。如典型的QC样品的总离子流色谱图(图3)所示,所选条件可以使未知化合物实现适当的分离。使用 MassHunter Profinder 软件(8.0版)对采集的数据进行递归分子特征提取(MFE),获得可靠的代谢物特征。 验证各组中与风味相关的代谢物 图2.代谢组学分析工作流程示意图 图3.典型的白茶QC样品的总离子流色谱图 化学计量学分析 将每个样品提取到的化合物结果导入 MPP(14.8版)软件中进行化合物比对和过滤,使得QC样品中所有化合物的变异系数均在30%以内。这样得到了包含1915种化合物的列表。基于这些化合物的PCA 得分图表明,通过这些化合物模式的差异可以将白茶样品类别分为:SN、WP和SM(图4A)。应用有监督的PLSDA模型,并根据化合物模式对该模型的样品预测进行了验证。基于所选化合物,PLSDA 得分图显示这些白茶样品按类别可以很好地分离(图4B)。混淆矩阵表显示 PLSDA模型预测的准确度很高(表2)。 表2.显示预测准确度的混淆矩阵表 SN, WP, SM, 准确度 (T)SN 10 0 0 100 (T)BP 0 8 0 100 (T)SM 0 0 11 100 整体准确度 100 T=实测值 p=预测值 初步鉴定出的代谢物 根据数据库搜索和精确 MS/MS 谱图解析鉴定得到99种代谢物。使用标准品对其中一些代谢物进行了进一步确认,如表3中所示。 图 4. PCA得分图(A)和 PLSDA 得分图(B)显示基于提取的1915种化合物可以对三种不同品质白茶实现很好的分离。红色圆形: WP;绿色正方形:SN;蓝色菱形:SM 表3.鉴定得到的代谢物及其保留时间、精确质量、质量偏差和MS2碎片 编号 鉴定的化合物 RT(min) 精确质量(m/z) 加合物 质量偏差 (ppm) MS2碎片 1 咖啡因* 10.53 195.0875 M+H -1 138,110,69 2 胆碱 1.49 104.107 M+H -4.8 60,58 3 可可碱* 6.46 181.0718 M+H -1.1 138,110,83 4 甜菜碱 1.58 118.0861 M+H -1.7 72,55 5 甘油磷酰胆碱 1.75 258.1084 M+H -6.6 184,104,60 6 茶氨酸* 2.07 175.1076 M+H -0.6 158, 130,84,56 7 苯丙氨酸 (Phe)* 5.06 166.0855 M+H -4.8 120, 103,91,77 8 异亮氨酸(IIe)* 3.27 132.1017 M+H -1.5 114,86,72,56 9 亮氨酸(Leu)* 3.03 132.1017 M+H -1.5 86,69, 56 10 脯氨酸 (Pro)* 1.66 116.0708 M+H 1.7 70,43 11 色氨酸 (Typ)* 7.79 205.097 M+H -1 188, 159,146,118 12 缬氨酸(Val)* 1.97 118.0862 M+H -0.9 72,63,58,55 13 酪氨酸 (Tyr)* 2.74 182.0809 M+H -1.7 136, 119, 91,77 14 天冬酰胺 (Asn)* 1.52 133.0606 M+H -1.5 74 15 谷氨酰胺 (GIn)* 1.54 147.076 M+H -2.7 130,84,56 16 天冬氨酸 (Asp)* 1.55 134.045 M+H 1.5 88,74,43 17 y-氨基丁丁 (GABA)* 1.52 104.0707 M+H 1 86,69 18 儿茶素(C)* 8.86 291.0865 M+H 0.7 139,123, 95 19 表儿茶素(EC)* 11.32 291.0864 M+H 0.3 207, 139, 123,55 20 没食子儿茶素 (GC)* 5.24 307.0815 M+H 0.7 223, 195,163,139 21 表没食子儿茶素(EGC)* 8.65 307.0813 M+H 0 289,153,139 22 表儿茶素没食子酸酯(ECG)* 13.27 443.0971 M+H -0.5 273, 153,139, 123 23 没食子儿茶素没食子酸酯(CG)* 11.63 459.0923 M+H 0.2 289, 181,153,139 24 表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG)* 10.43 459.0923 M+H 0.2 441,289, 153,139 25 表没食子儿茶素双没食子酸酯 13.45 611.103 M+H -0.2 441,289,153 26 表没食子儿茶素3-甲基没食子酸酯 12.31 473.108 M+H 0.2 455,289,167,139 27 表没食子儿茶素3-香豆酸酯 16.23 453.1178 M+H -0.4 435,209,139 28 表阿夫儿茶素* 13.39 275.0912 M+H -0.7 191, 139, 107, 55 *通过标准化合物确认 表3.鉴定得到的代谢物及其保留时间、精确质量、质量偏差和MS2碎片列表(续) *通过标准化合物确认 表3.鉴定得到的代谢物及其保留时间、精确质量、质量偏差和MS2碎片列表(续) *通过标准化合物确认 不同品质白茶间代谢物含量的差异 在99种鉴定的代谢物中,有64种代谢物的丰度在3种不同品质白茶间存在显著差异(P≤0.05)。采用层次聚类分析方法,对这64种代谢物的丰度变化进行了可视化分析。如图5所示,根据鉴定出的差异代谢物丰度变化模式,可以准确地对每一品质的白茶进行分组。这些代谢物主要包括四组化合物: 儿茶素/儿茶素二聚体 酚酸/水解单宁/氨基酸 ECG* EGCG* GCG 黄酮醇苷/黄酮苷生物碱/核苷酸/香气前体 Epigallocatechin digallate Epiafzelechin 3-gallate EGC EC* C* Procyanidin B1 这四组代谢物中,大多数黄酮醇苷/黄酮苷在白毫银针中的丰度最低,在白牡丹中的丰度相对较高,在寿眉中的丰度最高。 Procyanidin B2 Theasinensin A Theasinensin B Theasinensin C Theasinensin F Theaflavin Chlorogenic acid* Theogallin* Strictinin Trigalloyl glucose Quinic acid* 4-p-Coumaroylquinic acid Proline (Pro)* Valine(Val)* Isoleucine(lle)'Leucine (Leu)"Asparagine (Asn)'Aspartic acid (Asp)*Theanine"Pheylalanine(Phe)*Tyrosine(Tyr)*Glutamine (GIn)Kaempferol 3-0-glucoside*Kaempferol 3-0-galactoside*Kaempferol 3.7-dirhamnosideKaempferol 3-0-rutinosideKaempferol 3-0-glucosylrutinosideKaempferol 3-0-galactosylrutinosideKaempferol 7-(6'-galloylglucoside)Quercetin 3-0-glucuronideQuercetin 3-0-glucoside"RutinQuercetin 3-0-glucosylrutinosideQuercetin 3-0-galactosylrutinosideMyricitrin*Myricetin 3-0-glucosideApigenin-6-C-glucosyl-8-C-arabinosideApigenin-6-C-arabinoside-8-C-glucosideApigenin-6,8-C-diglucosideIsovitexin 2'-0-glucosideVitexin’Isovitexin*Benzyl primeveroside !Linalool oxide primeveroside isomer Linalool primeveroside (S)-5'-Deoxy-5'-(methylsulfinyl)adenosine 5'-Methylthioadenosine Adenosine Caffeine Choline Theobromine Betaine Theanine glucoside N-(1-Deoxy-1-fructosyl)leucine N-(1-Deoxy-1-fructosyl)phenylalanine o 图5.三种不同品质白茶中有显著差异的代谢物的丰度变化层次聚类分析图 差异代谢物含量与白茶风味的相关性研究 通过 Pearson 相关性分析,研究代谢物对特定茶风味未((包括鲜味、苦味和涩味 等)的影响。如图6A所示,64种代谢物中有41种与任一种风味都具有高度相关性(R²>0.9)。黄色或蓝色单元格分别表示代谢物丰度与相应的风味呈正相关 或负相关。图6A 表明大多数差异代谢物对三种风味表现出一致的影响趋势。图6B-6D 显示了三种不同品质白茶中的主要差异代谢物(Ps0.01)的丰度变化。 A 图6.鉴定的差异代谢物丰度与白茶品质(针对鲜味、苦味和涩味)的相关性。(A) Pearson 相关性图,显示了差异代谢物丰度与三种茶叶风味之间的正(黄色)相关性性负(蓝色)相关性;(B-D)主要差异代谢物的丰度变化,包括儿茶素和儿茶素二聚体(B),黄酮醇苷和黄酮苷(C),酚酸、水解单宁和氨基酸(D) 与白茶风味呈正相关的儿茶素和儿茶素二聚体在SN 和 WP中的含量相对高于SM中的含量(图6B)。黄酮醇苷和黄酮苷类化合物与白茶风味呈负相关,并且其中大部分在 SN 中的含量较低,而在WP和SM 中的含量则相对较高(图6C)。一些酸(例如Asn、TG 和和碱) 在 SN 和 WP中的含量较高,而其他酸的情况则恰恰相反(图6D)。 通过非靶向代谢组学分析,成功地对三种主要品质的白茶特征进行了研究。在鉴定出的差异代谢物中,有64种在三种不同品质白茶间存在明显的丰度差异,并且有41种与白茶的鲜味、苦味和涩味具有极好的相关性。以上结果表明,这些代谢物的含量对白茶的风味特征具有显著影响,有望作为标记物用于区分不同品质的白茶。 ( 1. Mao, J. T.; et al . White Tea ExtractInduces Apoptosis in Non-SmallCell Lung Cancer Cells: the Role of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-y and 15-Lipoxygenases.Cancer Prev. R es. 2 010, 3(9), 1132-1140 ) ( 2. Ning, J-M.; et al. ChemicalConstituents Analysis of White T e aof Different Qualities and D ifferentStorage Times. Eu. Food Res.Technol.2016,242(12), 2093-2104 ) ( 3. T an, J .; et al.Flavonoids, PhenolicAcids, Alkaloids and Theanine inDifferent Types of Authentic ChineseWhite Tea Samples. J. Food Compos. Anal.2017,57,8-15 ) 4. ( Dai, W.; et al. Nontargeted analysi s usi n g u ltraperformance liquidchromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometryuncovers the effects of harvestseason on the metabolites and taste quality of t ea ( Camellia sinensis L . ). J. Agric. Food Chem.2015,63, 9869-9878 ) 5. Tan, J.;et al. Study of the dynamicchanges in the non-volatile chemicalconstituents of black tea duringfermentation processing bya non-targeted metabolomicsapproach. Food Res. Intern.2016,79,106-113 糖基化广泛存在于植物的一系列生物过程中,并被认为对人体健康有益,但是有关这一生物过程的研究有限,其主要原因在于缺乏有效的分析方法鉴定植物中丰富多样的糖基化代谢物。本应用简报介绍了 Dai 等人最近报道的一种研究茶叶 (Camellia Sinensis L.) 中糖基化过程的非靶向特异性修饰代谢组学方法。将安捷伦超高效液相色谱 (UHPLC) 与高分辨率四极杆飞行时间质谱 (Q-TOF/MS) 结合使用,在全离子源内碎裂模式下对绿茶进行分析。利用实验室定制的工作流程对采集的数据进行处理,基于特定糖基化修饰的特征性中性丢失模式,选择性地提取与糖基化相关的化合物。直接在数据库中搜索糖基化代谢物或相应的底物,进一步鉴定这些化合物。借助这一策略,同时检测出 202 种糖基化代谢物,包括葡糖基化/半乳糖基化、鼠李糖基化、芦丁糖基化和樱草糖基化,其中在绿茶浸泡液中推断鉴定出 68 种糖基化代谢物。基于 MS/MS 谱图,初步解析出另外 44 种新型糖基化代谢物。此方法使用户能够分析、发现和鉴定植物样品中的新型糖基化代谢物。所述工作流程大大拓展了糖基化代谢物的鉴定范围,并提高了对未知代谢物进行结构解析的能力。该方法可以进一步扩展以分析植物中许多其他重要的修饰。
还剩8页未读,是否继续阅读?
安捷伦科技(中国)有限公司为您提供《茶叶中糖基化次级代谢物检测方案(液质联用仪)》,该方案主要用于茶叶中理化分析检测,参考标准--,《茶叶中糖基化次级代谢物检测方案(液质联用仪)》用到的仪器有Agilent 6545 Q-TOF 液质联用系统、Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统