废水出水样品中有毒化学物质检测方案(气质联用仪)

应用简报 Agilent环境Trusted Answers 使用高分辨率 Agilent 7250 GC/Q-TOF分析废水出水样品以鉴定有毒化学物质 安捷伦科技有限公司 Sofia Nieto 和 Kai Chen Thomas Youna ( 加州大学戴维斯分校土木与环境工程系，美国加利福尼亚州 ) 本研究使用一种大范围疑似物筛查工作流程，来鉴定废水出水中的有毒化学物质。该全面的分析方法将靶向和非靶向方法相结合，使用在多种电离模式下运行的高分辨率精确质量数 Agilent 7250 GC/Q-TOF、Agilent MassHunter 定量分析软件10.1中的 GC/Q-TOF 筛查工作流程以及农药和环境污染物的 GC/Q-TOF 精确质量谱库。 鉴定废水出水中的有毒化学物质是改善下游生态系统中环境水质的关键步骤。传统的靶向分析方法因适用范围有限，通常不足以鉴定毒性来源。通常采用非靶向分析的全面筛查有助于解决这一问题，并更深入地了解可能的毒性原因。为全面表征环境样品中的化学物质，需要将 LC和 GC分离技术与高分辨率质谱 (HRMS) 联用。否则，如果仅关注 LC/MS， 则可能会遗漏这些样品中存在的许多非极性和挥发性化合物。 GC/HRMS 的精确质量数以及软电离能够为未知物的鉴定或 NIST 谱库中初步匹配结果的验证提供重要的优势。 本研究将大范围疑似物筛查以及用于农药和环境污染物的非靶向方法相结合，使用高分辨率 GC/Q-TOF分析技术鉴定废水出水样品中的有毒化学物质。 样品 废水出水样水(94940、94941、94943 和94944)在连续五天的第1天、第2天、第4天和第5天采集，每个样品一式两份。前两个样品表现出对模糊网纹蚤(Ceriodaphnia dubia)的急性毒性，如排水综合毒性 (WET) 测试结果所示。 样品通过 GF/F 过滤器 (0.45 pm)过滤，流经亲水反相固相萃取柱。用乙酸乙酯和甲醇洗脱干燥的萃取柱。在超声浴中用己烷/丙酮1：1萃取干燥的过滤器。 将两种提取物混合，加入二溴八氟联苯(DBOFB) 作为内标。 使用与 Agilent 8890 GC 联用的高分辨率7250 GC/Q-TOF 对样品进行分析，其中 GC 采用 15×15m柱中反吹配置(图1).。利用20分钟保留时间锁定(RTL)方法(将甲基毒死蜱的 RT锁定至9.143分钟)，确保与农药和环境污染物的 GC/Q-TOF 精确质量谱库的 RT 保持一 致。该方法所用的反吹有助于保持一致的RT，避免交叉污染，延长色谱柱寿命，并减少离子源污染。 在电子轰击电离(EI)和负离子 CI (NCI)模式下对样品进行筛查，确保废水出水中常见的拟除虫菊酯和其他卤代化合物获得最佳分析灵敏度。随后利用正离子 CI (PCI)辅助化合物鉴定，因为它有助于形成分子离子加合物。分析条件如表1所述。 图1.柱中反吹配置。运行结束时反吹过程中的氦气流路以红色箭头指示。吹扫两通接头处的压力升高，而进样口的压力下降。这导致第一根色谱柱中的载气流向反转，并能通过分流出口除去高沸点化合物。气路反吹模块 (PSD) 是 Agilent 8890 GC 气路控制模块，提供了反吹功能，同时大大减少了载气消耗量 表1. GC/Q-TOF采集参数 GC和MS条件 EI 负离子CI 正离子CI GC Agilent 8890 GC 色谱柱 2根 HP-5ms UI， 15 m， 0.25 mm， 0.25 pm 色谱柱 进样口 MMI， 4mm UI单细径锥衬管，带玻璃毛 进样量 1pL 进样模式 冷不分流 进样口温度 60℃保持0.2分钟， 以600C/min 的速率升至320℃ 柱温箱升温程序 60℃保持1分钟；以40℃/min 升至 170℃； 以10°℃/min 升至310℃；保持3分钟 载气 氦气 色谱柱1流速 约1.2mL/min 色谱柱2流速 约1.4mL/min 反吹条件 5 min (后运行)，310℃(柱温箱温度)， 50 psi (辅助 EPC压力)， 2psi(进样口压力) 传输线温度 280°C 质量数范围 m/z 50-650 谱图采集速率 5 Hz 四极杆温度 150℃ 离子源温度 280℃ 150℃ 280°℃ 电子能量 70 eV 250eV 100 eV 发射电流 5 pA 10 pA 15 pA 疑似物筛查工作流程 在El模式下采集的 GC/Q-TOF 数据首先用 MassHunter 定量分析软件10.1中提供的 GC/Q-TOF 筛查工作流程进行处理。目标物列表基于经全面优化的精确质量数农药个人化合物数据库与谱库(PCDL)，该 PCDL 中包含 1000 多种独特的化合物。为提高数据处理速度和质量，在分析之前将 GC/Q-TOF 数据转换为 SureMass格式。筛查方法由 GC/Q-TOF农药和环境污染物 PCDL自动创建，共使用七个最具特异性的精确质量离子及其在每个谱图中的比率。筛查方法参数根据 SANTE 和FDA2指南进行设置，包括RT窗口、质量数准确度和谱库匹配得分等。 非靶向鉴定工作流程 在非靶向分析方法中，利用 MassHunter定量分析软件10.1中的未知物分析工具对El数据进行处理。在特征查找步骤之后， 执行 NIST17 谱库搜索，并在 AgilentMass Profiler Professional (MPP)中进行差异分析，以鉴定与废水出水样品更高毒性相关的化合物。为进一步鉴定非靶向筛查中的未知化合物或需要验证其特性化合物的分子离子，将 MassHunter定性分析软件10的分子式标注工具与El 和正离子化学电离 (PCI) GC/Q-TOF 配合使用。为了将 NCI GC/Q-TOF 数据与 GC/Q-TOF筛查工作流程配酒使用，基于在 NCI 模式下采集的谱图创建更聚焦的(约120种化合物，如拟除虫菊酯)精确质量数 PCDL. 然后，使用相同的 GC/Q-TOF 筛查工具对NCI 数据进行处理。 EI模式下的疑似物筛查 使用高分辨率 GC/Q-TOF 分析对模糊网纹蚤表现出不同程度的急性毒性(0%-80%)的废水出水样品。利用 MassHunter定量分析软件10.1中提供的筛查工作流程 (图2)监测GC/Q-TOF PCDL 中包含的许多重要农药和环境污染物。 使用该工作流程，通过 EI GC/Q-TOFPCDL 在各种废水出水提取物中鉴定出90多种化合物，质量数准确度<5 ppm，谱库匹配得分>75。图3显示了El筛查窗口以及报告的示例。在筛查工作流程中自动得到验证的化合物标记为绿色。 图2.组合污染物筛查工作流程基于使用 GC/Q-TOF PCDL 的靶向疑似物筛查方法和使用 NIST 谱库的非靶向筛查方法，所有筛查均采用 Agilent MassHunter 定量分析软件10.1 图 3. Agilent MassHunter 定量分析软件10.1中基于 EI PCDL 的筛查。自动验证的化合物标记为绿色。需要额外审查的化合物标记为橙色。下方显示了一个部分报告示例 需要进行额外手动审查的化合物标记为橙色。这些初步匹配结果((以橙色突出显示)即使只含一个失败的参数(例如谱库匹配得分或经验证的离子数量)，也可能是假阳性结果，除非它们的谱图中只有少数(而非选择性)离子或具有较低的响应。GC/Q-TOF疑似物筛查工作流程具有很高的灵活性，因此分析方法可以针对这些挑战性化合物进行专门优化。 在 GC/Q-TOF 筛查中鉴定出的化合物在不同样品之间表现出略有不同的响应水平，按其造成的模糊网纹蚤死亡率(%)分组列于表2中，其中某些化合物可能需要作为毒性诱因进行研究。 废水出水样品的NCI分析 在 NCI模式下对前文所述的废水出水提取物进行分析，以确保卤代污染物及其他含有吸电子基团的化合物获得最佳分析灵 敏度。 NCI 数据用相同的 GC/Q-TOF 筛查工作流程进行分析。创建了包含卤代硝基化合物及其他含有电子俘获基团的污染物更具体的 NCI 谱图 PCDL， 以便在 NCI模式下使用 GC/Q-TOF 筛查方法。平均而言，使用 NCI 模式和 NCI PCDL 能够在各种废水出水中可靠鉴定出约40种化合物。图4和表3显示了 NCI 筛查结果。尽管少数化合物只有一种主要离子或同位素簇并可能需要通过额外工作进行确认 表2.由El疑似物筛查得到的选定结果。响应值基于样品之间的相对水平进行颜色标记。还显示了定量离子的质量数误差以及谱库匹配得分 样品 死亡率80% 死亡率20% 死亡率0% LD94940-1 LD94940-2 LD94941-1 LD94941-2 LD94943-1 LD94943-2 化合物名称 响应 质量数误差 谱库匹配得分 响应 误差 质量数谱库匹配得分 响应 质量数误差 谱库匹配得分 响应 质量数误差 谱库匹配得分 响应 误差 质量数谱库匹配得分 响应 质量数误差 谱库匹配得分 TBEP/磷酸三(2-丁氧基乙基)酯 2013504 2.8 99.9 1502528 3.9 99.9 1289372 2.5 99.9 1559301 3.8 99.9 787113 3.1 99.9 784473 3.8 99.9 磷酸叔丁基苯二苯酯 16799 2.1 92.9 4948 3.2 74.6 2828 1.1 82.5 10468 0.8 91.9 2950 1.3 70.6 2766 0.8 91.9 氯虫苯甲酰胺 6298 0.2 76.8 5330 2.0 79.4 3572 1.7 63.2 3494 1.8 66.4 3458 1.1 52.4 2710 1.8 66.4 氟嘧醇 16518 1.3 80.4 15240 0.5 76.4 10698 2.6 73.7 12065 2.1 80.2 6038 2.0 74.2 4976 2.1 80.2 多效唑 16985 0.9 96.8 15763 1.6 98.7 10725 0.9 92.4 12090 2.1 94.9 9106 1.8 79.1 8448 2.1 94.9 TBZ/噻菌灵 1570235 1.4 99.7 1536170 2.4 99.7 1282402 0.6 99.7 1368732 2.2 99.8 774093 0.6 99.7 675439 2.2 99.8 嘧菌酯 134463 1.8 99.1 139960 3.0 98.9 109579 1.4 98.9 119004 1.7 98.8 104804 1.7 89.9 94511 1.7 98.8 表3.NCI疑似物筛查结果 样品 94940-1 94940-2 94941-1 94941-2 94943-1 94943-2 化合物名称 响应 谱库匹配得分 响应 谱库匹配得分 响应 谱库匹配得分 响应 谱库匹配得分 响应 谱库匹配得分 响应 谱库匹配得分 溴氰菊酯 16837 71.4 14202 42.7 6474 83.7 4138 36.3 3253 56.5 4294 36.3 硫丹硫酸酯 3372 98.8 3013 91.9 12182 98.9 11865 99.1 18103 98.8 15859 99.1 氟虫腈砜 1184481 99.4 989538 99.3 1058932 99.4 898204 99.3 1218463 99.4 1089462 99.3 毒虫畏 22450 94.7 13196 86.3 16668 94.4 14469 94.7 14757 95.7 12834 94.7 氟虫腈 1312800 98.7 1269915 97.7 1255881 97.1 1307988 96.8 1519654 95.8 1350814 96.8 氟虫腈亚砜 201344 99.9 192041 100.0 224062 100.0 218654 100.0 241255 100.0 274001 100.0 氯酞酸甲酯 1730 1409 94.1 1468 94.3 1489 96.2 2204 80.0 1807 96.2 三唑酮 22376 94.1 16547 94.2 19705 96.0 17006 96.4 18710 97.2 16675 96.4 马拉硫磷 474 86.6 249 86.6 0 0 一- 0 0 氟甲清 128886 97.8 111722 97.8 122423 97.8 119001 97.9 164450 97.8 135773 97.9 百菌清 23789 99.4 12226 99.2 14367 99.0 15765 99.1 14714 99.2 12680 99.1 B-BHC 36573 88.4 19696 91.7 25594 81.4 19439 84.7 23983 69.4 13527 84.7 氯硝胺 30089 92.3 33303 93.2 34005 92.6 39632 93.8 44118 95.1 35911 93.8 六氯苯 13573 99.3 10353 99.6 11863 99.3 9934 99.1 14371 98.7 12048 99.1 氟乐灵 10334 86.6 11119 94.1 12089 94.2 11454 92.8 13550 94.5 9293 92.8 2，4-二硝基甲苯 81406 90.1 91627 89.0 75770 84.4 67256 83.3 43423 91.1 41979 83.3 2，4，6-三氯苯酚 2551498 92.2 2250861 91.6 2525758 91.5 2544336 91.4 2707308 91.2 2736603 91.4 (图4A)，但是在甲烷 NCI 模式下，大多数化合物产生的碎片足以用于PCDL 筛查工作流程(图4B)。因此，只要提供相应的 PCDL， 该 GC/Q-TOF 筛查工作流程也可应用于 NCI 数据。 使用El和NCI 筛查方法在废水出水样品中鉴定出许多环境污染物，其中包括许多农药。但是，在废水出水样品中鉴定出的大多数化合物(包括氟虫腈和氟虫腈降解产物)没有毒性(表3)，不太可能是表现出的毒性的来源。 A 99.4 365.9362 10.694 0.013 85.5 167.1078 6 区37 Total： 112 Target lon Chlorothalonil NCI FormulaC8CI4N2 R.T.8.464 R.T. Diff0.173 Match Score99.4 265.8792 Mass Accuracy-0.1207 # of Verified lons 6 C6H6C16 8.524 0.013 93.0 70.9461 -3.3970 3 C12H4CI2F6N4 9.115 0.002 97.8 351.9956 1.4910 3 Bromacil NCI 314-40-9 9.494 0.131 96.1 260.0166 -2.3751 5 Chlorpyrifos NCI 2921-88-2 9.825 0.082 96.6 312.9502 -0.1504 Triadimefon NCI 43121-43-3 9.882 0.144 93.1 126.9956 -1.8779 3 Chlorthal-dimethy! (Dacthal or DCPA) NCI 1861-32-1 9.924 0.161 91.6 331.8997 -1.9129 4 8500 0 -500 De 81000 5000 -500- 70 8090 100 110 120 130 140150160170180 190200210220 230 240 250 260 270 280 290 300310320 Mass-to-Charge(m/z) B Screening-[Result Review] 口× X37 Total：112 Status Compound Name CAS# Formula RT R.T.DifE. Match Score Target lon Mass Accuracy # of Verified lons -2.3751 5 Chlorpyrifos NCI 2921-88-2 C9H11CI3NO3PS 9.825 0.082 96.6 312.950242 96.6 6 93.1 126.9956 3 Chlorthal-dimethyl (Dacthal or DCPA) NCI 1861-32-1 C10H6CI404 9.924 0.161 91.6 331.8997 -1.9129 4 2 2.5318 6 2 383.9677 -500 330.9674 365.9 De 号 8 0 -500 40 60 80 100 120 140.0 160 180200220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 Mass-to-Charge(m/z) 图4.在NCI 模式下使用疑似物筛查鉴定出的化合物示例。下方的镜面图显示了利用筛查算法选择的大多数特定离子的光谱匹配结果。A)具有极简单 NCI 谱图的匹配结果。B)在 NCI 谱图有足够数量离子供确认的匹配结果示例 为鉴定可能与废水出水毒性增加有关的其他污染物，使用非靶向工作流程对数据进行处理。该方法包括在未知物分析工具中进行特征查找，执行 NIST 17 谱库搜索，然后在 MPP中进行差异分析，以鉴定存在于表现出较高毒性的样品中更重要的化合物(图2)。 将已鉴定和未鉴定的组分从未知物分析工具中导出为化合物交换格式(.CEF) 文件，并导入MPP中。主成分分析(PCA)图表明，这些组分清晰地分为三组，分别对应于三种毒性不同的废水出水(图5)。 倍数变化与统计显著性的火山图有助于显示大型数据集的变化，在本研究中用于快速检测死亡率为80%和0%的化合物组之间的差异(图6)。与导致模糊网纹蚤零死亡率的废水出水提取物相比，导致模糊网纹蚤表现出80%死亡率的废水出水中存在许多含量明显更高的化合物。这些化合物可见于火山图的右上角，显示为红色。 X轴 图 5.PCA图，显示根据废水出水提取物的毒性将其 清晰地分为三组 图6.火山图，对死亡率为80%与死亡率为0%的化合物组进行比较。火山图右上角以红色方块标记的化合物是废水出水中含量明显较高的化合物，通过比较死亡率为80%的化合物组与死亡率为0%的化合物组而得出 为进一步考察废水出水的毒性与提取物中初步鉴定出的化合物之间的相关性，实施了相关分析。在倍数变化(FC) 截止值为2且p<0.05条件下得到所有三个排水毒性组的 FC 分析结果，将这些结果用作相关分析的实体列表(图7A)。选择死亡率百分比作为筛选参数。选择截止值为0.6的 Pearson 相似性指标，仅显示具有强相关性的化合物(图7B和图7C)。请注意，选择火山图和相关分析初步鉴定出的几种化合物(图6和图7C)进行进一步的化合物ID确认，如下一节所述。 初步匹配结果验证与未知物鉴定 利用未知物分析工具中的 ExactMass(碎片分子式标注)功能，确认废水出水毒性相关化合物的特性(图8A和图8B)。考虑到初步匹配结果的分子式，使用 NIST17.L谱库初步鉴定为2，2-二甲氧基-1，2-二苯乙酮的化合物(谱库匹配得分为85.9)的所有碎片离子均表现出较小的质量数误差(图8A)。由于第二种目标化合物碎片的 m/z 与初步匹配结果的分子式不匹配，因此该化合物鉴定错误(图8B)。由于该化合物的El 谱图未提供任何可检测的分子离子，因此使用 PCI 帮助鉴定分子离子，并结合MassHunter 定性分析软件的碎片分子式标注工具推测该未知物的分子式(图8C)。 PubChem 数据库建议该化合物的结构对应于乙酰柠檬酸三乙酯(图8C)，该结构与乙酰柠檬酸三乙酯的分子式相关性最高3。 B Compound Similarity Alignment Value Annotations CAS Number ChEBI ID CompoundNa..Tributy acetycit... 0.97073Tributyl acetycit...Tributy acetyicit... 77-90-7 Tributy acetycit...Ethanone， 2，2-d. 0.64071Ethanone， 2，2-d. Ethanone， 2，2-d.. 24650-42-8 Ethanone，2，2-Triisobutylalumi.. 0.86491Triisobutylalumi.. Triisobutylalumi.. 100-99-2 Triisobutylalumi...Tolbutamide 0.63448lTolbutamide Tolbutamide [C.. 64-77-7 Tolbutamide5-Methyl-1H-in.. 0.701395-Methy-1H-in.. 5-Methyl-1H-in.. 1000318-48-3 5-Methy-1H-in.. 图 7.在 Agilent MPP中进行相关分析。A) 三个废水出水样品之间的倍数变化(FC)分析；B)对参数输出进行筛选； C)使用0.6的相似性截止进进行相关分析所得的化合物列表 A B C 质荷比(m/z) 图8.利用具有 ExactMass 功能的未知物分析工具进行化合物验证和鉴定：(A)已确认的ID， (B)已拒绝的ID， 以及具有被拒绝 ID的化合物El谱图(C，上图)和PCI谱图(C，下图) 在 Agilent MassHunter 定性分析软件中的碎片分子式标注 使用 Agilent 7250 GC/Q-TOF 展示了一种将El 和 NCI 环境污染物疑似物筛查与非靶向筛查结合使用的方法。在样品中主要鉴定出的与某种程度毒性相关的一些目标化合物包括嘧醇、多效唑、嘧菌酯和氯虫苯甲酰胺等农药。 非靶向方法有助于鉴定可能与模糊网纹蚤死亡率相关的其他化合物。与疑似物筛查方法不同，虽然非靶向方法不太可能检测到痕量化合物浓度的细微差异，但它能够发现超出精确质量数 PCDL 范围的潜在污染物。 ( SANTE/11945/2015. Guidance document on analytical quality control and method validati o n procedures for pesticide residuesanalysis in food and feed (2015) ) ( F ood and Drug Administration.Department o f Health and HumanServices. Memorandum： Acceptance Criteria for Confirmation of I d entity of Chemical Residues using Exact Mass Data within the Office of Foods and Veterinary Medicine (2015) ) ( 3. K im， S. et al. PubChem 2019 Update： Improved Access to Chemical Data.Nucleic Acids Res. 2019， 47(D1)， D1102-1109 ) 查找当地的安捷伦客户中心：www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线：800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司，2019 5994-1345ZHCN 本研究使用一种大范围疑似物筛查工作流程，来鉴定废水出水中的有毒化学物质。该全面的分析方法将靶向和非靶向方法相结合，使用在多种电离模式下运行的高分辨率精确质量数 Agilent 7250 GC/Q-TOF、Agilent MassHunter 定量分析软件 10.1 中的 GC/Q-TOF 筛查工作流程以及农药和环境污染物的 GC/Q-TOF 精确质量谱库。