动物源性食品中11种合成类固醇类激素多残留检测方案(液质联用仪)

ApplicationNote： CM0004View additional Thermo Scientific LC/MS application notes at： www.thermo.com/appnotesS CIENTIFICPart of Thermo Fisher Scientific 高效液相色谱-串联质谱法检测动物源性食品中11种合成类固醇类激素多残留 刘 飞 赛默飞世尔科技(上海)公司色谱质谱部 关键词：： TSQ Quantum，合成类固醇类激素 (anabolic steroids)， LC/MS/MS Key Words·TSQ Quantum ·LC/MS/MS 合成类固醇类激素 (anabolic steroids) 合成类固醇类激素具有促进蛋白质合成的作用，雄性化作用是其主要特点。雄激素(俗称“合成类固醇")及其相关物质是历史最悠久、最重要的违禁药品之一，在畜牧业、体育运动和保安业中一直被广泛的非法使用。早在二战时期即在德军中使用以提高战斗力。些统计资料显示，在食品甾体类同化激素 (anabolic steroidsASs)残留和体育运动兴奋剂监测中，雄性激素占阳性样品的60%以上。长期使用或摄入会干扰人体正常的激素平衡，男性出现睾丸萎缩、胸部扩大、早秃、肝、肾功能障碍或肝肿瘤。女性出现雄性化，月经失调、肌肉增生、毛发增多等。 由于兴奋剂检测可轻而易举地查出运动员是否服用了苯丙胺，至20世纪70年代初，使用这类药物的运动员已明显减少。取而代之的是50年代以来相继问世的多种合成类固醇，这类可以使肌肉增大和力量增强的兴奋剂同时严重干扰体内激素平衡。因为一直未研究出准确而可靠的检测方法，国际奥委会迟至1975年才宣布禁用合成类固醇。因此，对合成类固醇类激素的检测不仅在体育运动中，而且在食品安全方面都有重要意义。 本文建立了猪、牛、羊及鸡肌肉和肝脏、牛奶和鲜蛋等动物源性食品中睾酮、甲基睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙等11种合成类固醇类激素药物的液相色谱-串联质谱测定方法。 1.实验部分 1.1仪器与试剂 TSQ Quantum三重四极杆串联质谱仪(赛默飞世尔科技Thermo Fisher Scientific公司)，配置有电喷雾电离源((ESI) ： Surveyor MS Pump液相色谱系统，包括Surveyor AS自动进样器。标准品睾酮 (Testosterone)、甲基睾酮 (Methyl testosterone)、黄体酮 (Progesterone)、群勃龙 (Trenbolone)、勃地龙(Boldenone)、诺龙 (Nandrolone)、美雄酮(Methandienone)、司坦唑醇 (Stanozolol)、、丙酸诺龙(Nandrolone propionate)、丙酸睾酮(Testosteronepropionate)及苯丙酸诺龙 (Nandrolone phenylpropionate)纯度均大于98%。用甲醇溶解并配制成1.0 mg/mL标准储备液，再根据需要稀释成适当含量的混合标准工作液。其他试剂均为HPLC色谱纯。 1.2样品制备 1.2.1取样 称取约500g动物肌肉、肝脏，完全切碎后，匀浆备用；取10枚鲜蛋，去壳，均质备用；取鲜牛奶500 mL， 混匀备用 1.2.2提取 试样5 g， 置于50 mL离心管中，加入10%碳酸钠溶液3 mL和10 mL乙酸乙酯，均质30 s，振荡10 min (4℃))，6000 r/min离心10 min， 将上层有机相转移至梨形瓶中。再用10 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并上层有机相。在40℃下，旋转蒸发至干。用50%乙腈水溶液1mL溶解残余物，溶液冷冻30 min， 16000 r/min离心5 min， 取适量溶液经0.22um滤膜过滤后，供LC/MS/MS法测定。 1.3液相色谱及质谱条件 1.3.1色谱条件 色谱柱：Thermo Hypersil Gold(150 2.11 mm，5卜um)；梯度洗脱见表1，其中A：水(0.1%甲酸))：：B：甲醇；流速：250uL/min；进样量：10 uL Time ((min) A(%) B(%) 10 5 101090 90 12 90 10 1.3.2质谱条件 电喷雾电离源(ESI)，正离子模式；选择反应监控(SRM)扫描模式，喷雾电压：4500V；离子传输管温度：350℃；氮气作为鞘气和辅助气，其中鞘气为35 arb， 辅助气为5arb， 司气用作碰撞气，碰撞压力为1.5 mTorr；选择反应监监 (SRM)离子对见表2。 表211种合成类固醇类激素的SRM质谱条件 药物名称 母离子 碎片离子(碰撞能量V) 1234567891011 睾酮 (Testosterone) 甲基睾酮(Methyl testosterone)黄体酮 (Progesterone) 群勃龙(Trenbolone) 勃地龙(Boldenone) 诺龙 (Nandrolone) 美雄酮(Methandienone) 司坦唑醇 (Stanozolol) 丙酸诺龙 (Nandrolone propionate) 丙酸睾酮 (Testosterone propionate) 苯丙酸诺龙(Nandrolone phenylpropionate) 289.2 303.2315.2271287.2275.2301329.2331.1345.2 407.2 97.2(24)，109.2(26)，253.2(16)97.2(30)，109.1(28)，285.1(17) 97.2(22)，109.1(27) 199(26)，253(20) 121(25)，135(15)，269(12)109(28)，257(15) 121(27)，149(15)，283(12)81(42)，121(36)， 95(38)239(17)，257(14) 97.1(29)，109.1(28) 105.2(29)，257.1(17) 2结果与讨论 2.1方法灵敏度(定量限，LOQ))：本方法在猪、牛、羊、鸡肌肉组织、鸡蛋中，睾酮、甲基睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙的检测限均可达到0.1ug/kg， 本方法在各肌肉组织、鸡蛋、牛奶中的睾酮、甲基睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、丙酸酸酮及苯丙酸诺龙的定量限为0.5ug/kg。图2为得到的典型LC/MS/MS色谱图。 NL： 1.52E4 图211种合成类固醇类激素LC/MS/MS色谱图(1.0 ng/mL) 2.2方法准确度：本方法合成类固醇类激素在猪、牛、羊肌肉，鸡肉，鸡蛋，牛奶等动物源性食品中的提取回收率均可达50-105%，满足国内外的最低检出限要求，并且定量定性准确，重现性好。 3结论 In addition to theseoffices. Thermo FisherScientific maintainsa network of represen-tative organizationsthroughout the world. 本方法建立了11种合成类固醇类激素在猪、牛、羊肌肉，鸡肉，鸡蛋，牛奶等动物源性食品中的LC/MS/MS检测方法，其基本原理为：组织匀浆样品及牛奶在碱性条件下，经乙酸乙酯提取，提取液蒸干后用50%乙腈水溶液溶解残渣，高效液相色谱普串联质谱((LC/MS/MS)法检测。方法灵敏度、提取回收率、重现性等均满足国内外监控和检测要求。 赛默飞世尔科技 上海 上海浦东新金桥路27号6号楼 电话：86-21-68654588 传真： 86-21-64457830 北京 北京市东城区安定门东大街28号 雍和大厦西楼702-715室 电话：86-10-8419 3588 传真： 86-10-8419 3589 广州 广州东风中路410-412号 健力宝大厦3003-3004室 电话：86-20-8348 7138 传真：86-20-83486621 服务热线： 800 8105118 400650 5118 www.thermo.com analyze.cn@thermofisher.com Thermo 由于兴奋剂检测可轻而易举地查出运动员是否服用了苯丙胺,至20世纪70年代初,使用这类药物的运动员已明显减少。取而代之的是50年代以来相继问世的多种合成类固醇，这类可以使肌肉增大和力量增强的兴奋剂同时严重干扰体内激素平衡。因为一直未研究出准确而可靠的检测方法，国际奥委会迟至1975年才宣布禁用合成类固醇。因此，对合成类固醇类激素的检测不仅在体育运动中，而且在食品安全方面都有重要意义。本文建立了猪、牛、羊及鸡肌肉和肝脏、牛奶和鲜蛋等动物源性食品中睾酮、甲基睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙等11种合成类固醇类激素药物的液相色谱-串联质谱测定方法。1. 实验部分1.1 仪器与试剂TSQ Quantum三重四极杆串联质谱仪（赛默飞世尔科技Thermo Fisher Scientific公司），配置有电喷雾电离源（ESI）；Surveyor MS Pump液相色谱系统，包括Surveyor AS自动进样器。2 结果与讨论2．1 方法灵敏度（定量限，LOQ）：本方法在猪、牛、羊、鸡肌肉组织、鸡蛋中，睾酮、甲基睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙的检测限均可达到0.1 μg/kg，        本方法在各肌肉组织、鸡蛋、牛奶中的睾酮、甲基睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙的定量限为0.5 μg/kg。