大米中代谢组学检测方案(气质联用仪)

样品前处理 结论 应用气相-三重四极杆质谱对不同基因型大米的代谢组学研究 Jeremy P. Matthews1， Silvia Gemme?， Hans-Joachim Huebschmann1Cindy Llorente3， Rosario Jimenez3， Nese Sreenivasulu31Thermo Fisher Scientific， Singapore， 2Alpha Analytical Pte. Ltd.， Singapore，3International Rice Research Institute， Philippines 全自动 SRM离子对优化软件(AutoSRM)；生物标记物；食品；代谢组学； MRM；营养学；大米 前言 代谢组学是一门应用高通量测试平台研究生物代谢过程中的小分子代谢物的科学。作为生物体内众多代谢反应的产物，其代谢物的含量始终处于动态变化中。因此，所谓“代谢组特征”反映的是来自于活体组织的生物样本的生理状况。1 对于植物来说，其代谢组主要受遗传基因以及环境影响等外部刺激作用而在生长过程中不断变化。因而，通过测试所获得的代谢组特征仅为该植物某组织器官在特定生长阶段生理状况的剪影。对样本中代谢物的定性和定量结果可作为此代谢组状态的“指纹图谱”或指示谱图。据估计，所有植物生长过程中存在超过20万种代谢物，这些代谢物数量众多，结构复杂多样。? 代谢组学分析的最大挑战在于代谢物结构性质的多样性以及含量的巨大差异。要对整个代谢组体系中的代谢物进行测试，必须应用多种测试平台。 对于研究可通过化学衍生法处理进行气相色谱分析的低分子量代谢物来说，气相色谱与质谱联用(GC-MS)是绝佳的测试工具。在使用气质联用仪一级全扫描模式表征代谢物，可识别相关代谢物并提供其归一化相对含量信息，然而，对代谢物整体定量研究的要求是获得准确的绝对定量信息。在研究大米等某一植物时，需要对作为功能基因组学工具或区别不同种属、品质大米的生物标记物的目标代谢物进行准确定量。 三重四极杆质谱仪由于其在复杂有机样本中对待测物进行定性和定量的能力而成为代谢组学研究中极具价值的工具之一。3，4三重四极杆质谱的主要优势是利用其多重反应监测(MRM) 功能，，一次进样同时定性和定量上百种代谢物。MRM数据采 集模式通过监测目标代谢物独特的、保留时间相关的母离子-子离子转化反应，有效消除基质和噪音的干扰。并且，共流出化合物也可以分别定量，无需通过数学计算进行解卷积处理。作为一种食物来源，大米对于我们至关重要，它为约21%的人口提供了能量供了(http：//www.knowledgebank.irri.org/)。大米的代谢组研究可用于对不同大米样本进行“指纹图谱”识别，以鉴定出具有发展潜力的种属，从而拣选更好品质、具备更多营养成分的大米。位于菲律宾马尼拉的国际稻米研究机构(International Rice Research Institute，IRRI) 是目前亚洲最大的非营利性农业研究中心。IRRI以提高稻米产量和营养成分为目标，专注于稻米的新品种开发。本次分析目的是考察GC-MS/MS测试平台对于检测不同基因型成熟稻粒目标代谢物的适宜性。本实验与 IRRI 合作完成，旨在建立表征不同种类稻米的代谢特征的测试流程。 大米提取物的衍生化处理依据 Zhou 等人5发表的用于表征糙米代谢组学特征而优化的方法完成。将新鲜脱壳的稻粒浸泡于液氮中，之后研磨过60目网筛。称量300毫克糙米粉末，加入3mL甲醇/水溶液(4：1v/v)，另加入100 uL 癸酸溶液(0.30 mg/mL)作为内标物质。上述样本涡旋1分钟并静置30分钟，经超声处理60分钟后12000g离心10分钟。取2mL 上清液冻干，加入90 uL含1%三甲基氯硅烷(TMCS)的双三甲基硅烷基三氟乙酰胺(BSTFA) 和 80 pL吡啶进行衍生化。混合物经75℃水浴45分钟后移入装有 200 pL内插管的2mL气相色谱样品瓶中，用于 GC-MS/MS 分析。所有样本均在衍生化处理后24小时内完成测试。5 12份大米提取物衍生化样本均应用 Thermo ScientificTM TSQTM8000 三重四极杆 GC-MS/MS 系统联用 Thermo ScientificTMTRACETM 1310 气相色谱分析，气相色谱仪同时配备有分流不分流进样口 SSL 即时连接的 SSL 模块和 Thermo ScientificTMTriPlus RSHTM 自动进样器。具体仪器方法见表1。 样品测试 整个代谢组学测试流程包括两个部分，两部分均在 TSQ 8000质谱仪上测试完成，详见图1。 图1.分别应用一级质谱全扫描进行无目标性分析和 MRM 扫描进行目标性分析的代谢组学测试流程展示 色谱柱型号 Thermo ScientificTM TRACETM TR-5MS 色谱柱尺寸 长30m，内径0.25 mm， 膜厚0.25 um ( P/N 260F142P) 进样器，温度 即时连接 SSL， 285℃ 分流流速 12 mL/min 进样模式，体积 分流1：10 载气，流速 氦气，稳定流速，1.2 mL/min 升温程序 60℃保持4分钟 8℃/min 升至170℃ 4 ℃/min 升至 300℃ 300℃保持15分钟 传输线温度 285℃ 表2.第一部分，无目标性分析质谱条件一级质谱全扫描 离子化模式 El， 70 eV 扫描模式，扫描 一级质谱全扫描， 40-600 Da 范围 扫描速率 250 ms 离子源温度 300℃ 表3.第二部分，目标性分析质谱条件- SRM 离子化模式 El， 70 eV 扫描模式，扫描 同时进行 SRM/一级质谱全扫描 范围 一级质谱全扫描，40-600 Da SRM 模式，详见附录1的 SRM 离子反 应信息 采集速率 10ms 离子源温度 300℃ 图1展示了代谢组学研究的通用测试流程，首先是第一部分，无目标性地检测样本中化合物成分；之后进行第二部分，对第一部分中鉴定的代谢物进行目标性的定量分析。 第一部分分析需要通过对一级质谱全扫描数据进行谱图数据库检索来完成相关化合物鉴定。 第二部分分析则通过选择性反应监测(SRM)模式来对复杂基质中痕量化合物进行准确定量。 最终用于选择性定量的多重反应监测(MRM)是由众多单独的选择性反应监测组成的。 TSQ 8000 系统同时进行一级质谱全扫描和 SRM 扫描的能力出色，能够直接采集到第一部分和第二部分所需要所有数据。仪器同时进行一级质谱全扫描和 SRM 扫描的能力使得实验人员可以在一次测试中不仅对已知代谢物定量(目标性)的同时，鉴定未知代谢物(无目标性)。在所有测试流程中，化合物的色谱保留时间是不变的，这一点不仅可作为化合物鉴定的依据之一，更可以加快建立目标性 MRM测试方法进程。因此， Thermo ScientificTSQ 8000 三重四极杆质谱系统是同时进行未知化合物表征以及目标化合物广泛定量的理想测试平台。 本次应用 TSQ 8000 GC-MS/MS 系统进行代谢组学研究的两部分数据对于深入了解稻米品质具有重要参考价值。 结果 第一部分一无目标性分析 测试流程中的第一部分，共测试了5种不同的大米样本。之所以选择这几种大米，是由于它们不同的特性，这样更有可能测试出含量具有显著差异的代谢物。测试样本的一级全扫描离子流图见图2. 选择其中一个样本(3号样本)来建立和优化 SRM 方法。这个样本中含有大量有意义的代谢物。 TSQ 8000三重四极杆质谱仪配置了全自动 SRM离子对优化( AutoSRM)功能，这个软件包可以快速、自动化地建立和优化SRM 分析方法。利用该功能建立一个优化 SRM 方法步骤如下： 1.分析母离子一根据一级全扫描数据，选择出66种感兴趣的代谢物，每个代谢物选择2-3个母离子。本步骤需要单独进行一次 GC-MS/MS 测试，选择出的相关母离子将进行进一步的子离子分析。 2.子离子分析一选出在第一步中各代谢物选出的母离子的相应子离子。每个代谢物均被选出多个产物离子，这导致每个代谢物有3-7对母离子子离子离子对用于 SRM 优化分析。 3.SRM 优化分析一优化每对母离子-子离子离子对的碰撞能量，以获得最大的离子强度，即灵敏度。在目标代谢物进入质谱仪后，对其进行快速梯度能量轰击以提高离子强度。通过实时直接控制仪器，在单次测试中试验了多个碰撞能量，从而极大地缩短了建立和优化 SRM 方法所需要的周期。仅测试了5针样品就所有66种代谢物的 SRM 方法优化。 通过质谱图自动解卷积和鉴定软件(AMDIS) 对 TSQ 8000测试所得的复杂离子流图进行解卷积处理，并应用美国国家标准与技术研究院(NIST) 的质谱图数据库进行谱图检索。上述的66 种进行 AutoSRM 优化的代谢物均通过2011 NIST 质谱图数据库检索匹配其一级全扫描质谱图以完成鉴定。 由于多种同分异构体的单糖和双糖化合物具有相似的质谱图特征，这些峰经数据库检索给出多个可能的化合物结构。而这些化合物可通过测试相应的标准对照品以及比较保留时间先后来推测其具体化学结构。鉴定所得的代谢物包括氨基酸、有机酸、脂肪酸、醇类和糖类(单糖和双糖)。以上代谢物通过 SRM 模式进行进一步检测，具体离子转化反应信息见附录1。 第二部分一目标性定量分析 将上文所述的 AutoSRM 优化结果导入 TraceFinder 定量软件中，自动建立数据处理方法。再次测试5号大米样本来检查 SRM 优化结果的有效性，详见图3。 重复测试10次衍生化的9号大米样本并分别计算66种代谢物的RSD 来评价整个代谢组学测试方法的重复性。重复性考查结果见图4。 即使在大米提取物较大的基质干扰下，痕量目标代谢物的峰面积依然表现出良好的重复性。66种代谢物的平均 RSD 为7.8%， 其中96%的代谢物 RSD 小于 15%， 74%的代谢物 RSD 小于 10%。应用优化好的 MRM 方法检测12种不同种类的稻米潜在的生物标记物，即寻找可以区别大米种类的代谢物。各代谢物的相对含量以“热图”( heat map)的形式展示出来，见图5. 图3.5号大米样品的 SRM 离子流图 图4.9号大米样品中66种代谢物的峰面积重复性 图5.1-12号大米提取物样品中66种代谢物的 SRM 扫描结果热图比较(代谢物编号具体参考附录1)。 图5的热图展示了12个大米样品中66种代谢物的相对含量。所有峰面积均通过内标物质校正，并对最终峰面积数据归一化处理。这样，样品中含量最高的代谢物的相对值标记为100%，其它代谢物以此为基准进行归一化。热图中绿色和红色对应相关化合物相对浓度 0%到100%，中间浓度以黄色和橙色表示。 热图通过色彩对比形象展示了12种大米样品中各代谢物的相对含量。 由热图可以看出，12种大米样本中的66种代谢物含量差异巨大。所有的测试代谢物均为潜在的生物标记物，，可用来对不同种类大米进行区别。应用主成分分析(PCA)对大米的定量代谢组数据进行分析，寻找与稻米种类、品质相关的代谢标记物。 使用 TSQ 8000 同时进行一级全扫描/选择性离子反应监测模式对12种大米样品中的代谢物进行定量测试，这样不仅获得了用于准确定量的高灵敏度、高选择性的 SRM 数居(第二部分-目标性分析)，还能够通过一级全扫描模式数据对新化合物进行鉴定(第一部分-无目标性分析)。 为了了解在一级全扫描/选择性离子反应监测模式下的采集的一级全扫描数据信息，我们使用NIST 谱库检索未知化合物。图6展示的是样本中某化合物的离子流图及相应的质谱图。 图6的上半部分展示的是13号大米样品一级全扫描/选择性离子反应监测模式下下总离子流图(TIC)。色谱保留时间为30.65 min 和 30.78 min 的两个黑色峰对应经 AutoSRM 优化进行 SRM 扫描的两个化合物。而色谱保留时间为 31.35 min的峰为一未知化合物，故 SRM通道未对其进行扫描。图6的下半部分展示了该未知化合物的一级质谱图。该图可用于NIST 谱库检索，以鉴定化合物。 图6.上图为一级全扫描/选择性离子反应监测模式下的总离子流图(TIC)；黑色的峰为 SRM 扫描形成。下图为色谱保留时间为31.35 min 的未知峰的一级质谱图。 图7展示示13号大米样品中色谱保留时间为 31.35 min 的未知化合物经 NIST 谱库检索的结果。图中比较了未知化合物的一级质谱图(红色)与 NIST谱库中最高匹配度的硬脂酸三甲基硅烷酯标准谱图(蓝色)。谱库匹配未知化合物与该标准谱图的可能性为94.8%。高质量的谱图匹配结果表明了 TSQ 8000 GC-MS/MS 仪器在完成 SRM 扫描的同时，提供高品质、可直接用于标准谱库匹配的一级质谱图的出色能力，这完全满足了代谢组学测试流程中无目标性分析和目标性分析的测试要求。 图7.在一级全扫描/选择性离子反应监测模式下获取的保留时间为 31.35 min 的未知化合物与 NIST 谱库匹配的结果。上图(红色)为未知化合物谱图，下图(蓝色)为 NIST 谱库中匹配度最高的标准谱图(硬脂酸三甲基硅烷酯) 附录1一在第一部分无目标性分析中选出的66种代谢物经 AutoSRM 优化的结果。 定量峰 定性峰 化合物编号 化合物名称 保留时间(min) 母离子 子离子 碰撞能量(eV) 母离子 子离子 碰撞能量 (eV) 1 N，N'-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamidine 6.37 99.0 69.0 30 99.0 71.0 10 2 Ethylbis(trimethylsilyl)amine 6.59 100.1 59.1 10 174.1 59.1 20 3 Silanamine， N，N'-methanetetraylbis[1，1，1-trimethyl- 6.92 78.1 64.0 12 78.1 71.3 12 4 1，2-Bis(trimethylsiloxy)ethane 7.44 148.8 45.0 30 148.8 75.0 10 5 Butane， 2，3-bis(trimethylsiloxy)- 8.73 8.73 118.4 45.6 18 118.4 75.2 8 6 I-Alanine， N-(trimethylsilyl)-， trimethylsilyl ester 10.06 116.1 43.0 28 116.1 45.1 18 7 Glycine， N-(trimethylsilyl)-， trimethylsilyl ester 10.48 102.1 45.1 20 102.1 58.0 30 8 Phosphoric acid，bis(trimethylsilyl)monomethyl ester 11.55 133.0 115.0 10 163.1 133.1 10 9 L-Valine， N-(trimethylsilyl)-， trimethylsilyl ester 12.32 144.1 43.0 32 144.1 58.1 32 10 2-(4-Methoxyphenyl)-2-(4-trimethoxysilyloxy)propane 13.36 299.1 151.1 10 300.5 74.1 10 11 Glycerol， tris(trimethylsilyl) ether 13.43 116.9 59.1 10 116.9 89.1 10 12 Butanedioic acid， bis(trimethylsilyl) ester 14.14 74.8 47.0 10 148.5 45.2 30 13 Serine， N，O-bis(trimethylsilyl)-， trimethylsilyl ester 14.94 205.5 205.3 10 218.2 45.1 30 14 N，O，O-Tris(trimethylsilyl)-L-threonine 15.37 100.6 86.1 10 117.1 43.0 30 15 Decanoic acid， trimethylsilyl ester 16.57 229.1 47.0 32 229.1 131.1 12 16 Butanedioic acid， [(trimethylsilyl)oxy]-， bis(trimethylsilyl) ester 17.04 189.7 147.1 10 233.1 73.1 10 17 Acetic acid，iodo-， trimethylsilyl ester 17.23 100.0 59.1 10 115.0 59.1 20 18 Threitol， 1，2，3，4-tetrakis-O-(trimethylsilyl)-， D- 17.35 205.3 117.1 8 205.3 147.1 8 19 L-Aspartic acid， N-(trimethylsilyl)-， bis(trimethylsilyl)ester 17.53 232.1 100.1 8 232.1 188.2 8 20 3-Trifluoromethylbenzylamine，N，N-dinonyl 17.73 171.1 73.1 22 314.1 73.1 22 21 Glutamic acid， N-(trimethylsilyl)-， bis(trimethylsilyl) ester， L- 19.12 128.1 73.1 10 246.1 73.1 20 22 Amine， N，N，N-tris((trimethylsilyloxy)ethyl)- 19.24 223.2 73.1 22 262.3 82.1 12 23 L-Asparagine，N，N2-bis(trimethylsilyl)-， trimethylsilyl ester 19.94 231.1 116.1 8 231.1 132.2 8 24 Arabinitol， pentakis-O-(trimethylsilyl)- 20.84 204.8 117.1 10 204.8 147.2 10 25 Phosphoric acid， bis(trimethylsilyl) 2，3-bis[(trimethylsilyl)oxy]propyl ester 21.59 299.2 147.2 20 299.2 225.2 10 应用 Thermo Scientific TSQ 8000 对IRRI提供的不同基因型的大米进行代谢组学表征研究，旨在鉴定出能够区别不同种类、品质大米的潜在生物标记物。无论代谢组学测试流程中的无目标性分析还是目标性定量分析， TSQ 8000 均运行良好，展现了它的一级质谱全扫描、SRM 和同时进行一级质谱全扫描/ SRM扫描模式对于表征、定量宽动态范围内的主要代谢物的独特优势。 尽管 TSQ 8000质谱仪是一台三重四极杆质量分析器，在一级质谱全扫描模式下所获得的谱图仍与 NIST 标准谱库具有良好的匹配度。通过标准谱库检索可对未知化合物进行匹配鉴定，结果置信度高。同分异构体化合物则可根据其色谱保留时间不同而进行区别，并可根据其特定的质谱碎裂特征进行选择性定量。 利用TSQ 8000 配置的 AutoSRM 软件包建立并优化大米样品中包括氨基酸、有机酸、脂肪酸、醇类、糖类(单糖、双糖)在内的66种代谢物的 SRM 方法。整个 SRM 方法可在24小时以内建立并完成优化，并对12种不同的大米样品中的代谢物进行测试。定量结果具有高重复率，即使是在基质复杂的衍生化大米提取物样品中，超过90%的代谢物 RSD 小于 15%。 经测试，所有目标代谢物在各大米样品中含量差异明显，均有作为鉴定不同种类大米的生物标记物的潜力。本次实验对于未来的水稻多样性研究打下良好基础，有助于提高稻谷品质和大米营养价值。 ( 参考文献 ) ( 1.Weckwerth， W.， K. 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Mallard， W.G.， Reed， J.， AMDIS User Guide， N a tionalInstitute of Standards and Technology (NIST)， 1997. ) 更清洁 关于赛默飞世尔科技 赛默飞世尔科技(纽约约交所代码： TMO)是科学服务领域的世界领导者。公司年销售额170亿美元，在50个国家拥有约50，000名员工。我们的使命是帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。我们的产品和服务帮助客户加速生命科学领域的研究、解决在分析领域所遇到的复杂问题与挑战，促进医疗诊断发展、提高实验室生产力。借助于首要生牌 Thermo Scientific、AppliedBiosystems、Invitrogen、Fisher Scientific 和 Unity Lab Services， 我们将创新技术、便捷采购方案和实验室运营管理的整体解决方案相结合，为客户、股东和员工创造价值。欲了解更多信息，请浏览公司网站： www.thermofisher.com 赛默飞世尔科技中国 赛默飞世尔科技进入中国发展已有30多年，在中国的总部设于上海，并在北京、广州、香港、台湾、成都、沈阳、西安、南京、武汉等地设立了分公司，员工人数约3700名。我们的产品主要包括分析仪器、实验室设备、试剂、耗材和软件等，提供实验室综合解决方案，为各行各业的客户服务。为了满足中国市场的需求，现有8家工厂分别在上海、北京和苏州运营。我们在全国共设立了6个应用开发中心，将世界级的前沿技术和产品带给国内客户，并提供应用开发与培训等多项服务；位于上海的中国创新中心结合国内市场的需求和国外先进技术，研发适合中国的技术和产品；我们拥有遍布全国的维修服务网点和特别成立的中国技术培训团队，在全国有超过2000名专业人员直接为客户提供服务。我们致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。欲了解更多信息，请登录网站 www.thermofisher.cn 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 www.thermoscientific.cn 全国服务热线：8008105118400 650 5118(支持手机用户) C 应用 Thermo Scientific TSQ 8000 对 IRRI 提供的不同基因型的 大米进行代谢组学表征研究，旨在鉴定出能够区别不同种类、 品质大米的潜在生物标记物。无论代谢组学测试流程中的无目 标性分析还是目标性定量分析，TSQ 8000 均运行良好，展现了 它的一级质谱全扫描、SRM 和同时进行一级质谱全扫描 / SRM 扫描模式对于表征、定量宽动态范围内的主要代谢物的独特优 势。