动物细胞中细胞培养污染防治检测方案(培养箱)

二氧化碳培养箱的常见污染及防控措施 二氧化碳培养箱用途广泛，主要用来培养细胞、组织和某些特殊微生物，为它们提供一个良好的体外培养环境，广泛应用于细胞学实验、微生物学实验、组织学实验以及分子生物学实验。因此，二氧化碳培养箱的清洁维护尤为重要。 二氧化碳培养箱的常见污染 　　进入二氧化碳培养箱培养环境中，对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染。不同的污染物对细胞的影响也有差别，有的影响是长期、缓慢和潜在的，而有的则能在很短的时间内抑制细胞生长或杀死细胞。根据污染源不同主要可以分为：生物性污染、化学性污染、物理性污染和气溶胶污染。 　　1、生物性污染： 　　这是最常见也是危害最大的污染。如细菌、病毒、真菌，支原体等。这些污染源有可能是人为带入，或是细胞在放入二氧化碳培养箱前已经受污染，再或者是箱体本身没有消毒干净。体外培养的细胞自身没有抵抗污染的能力，而培养基中所加抗生素的抗微生物污染的能力也是有限的，因而细胞微生物污染一旦发生往往是无法挽救的。 　　2、化学性污染： 　　二氧化碳培养箱中许多化学物质都可以引起细胞污染。如细胞培养容器清洗过程中残留的洗涤剂、加湿器中未纯化的水、人为带入的液体或气体都可能成为化学性污染的来源。不同化学物质对细胞污染是不一样的，有的可能促进或抑制细胞生长，有的甚至杀死细胞。 　　3、物理性污染： 　　培养环境中的物理因素，如温度、放射线、振动、辐射（紫外线或荧光）会对细胞产生影响。物理性污染常常被人们所忽视，其主要是在代谢水平或分子水平上，影响细胞正常的生理过程。 　　4、气溶胶污染： 　　气溶胶是液体或固体微粒均匀地悬浮在气体介质中的分散体系，当微粒是微生物时，就是微生物气溶胶，如果这种微生物是病原性的，就是病原微生物气溶胶。细菌、病毒等病原体通过气溶胶可在人与人、人与环境之间传播。 二氧化碳培养箱污染防控措施 　　1、二氧化碳培养箱的选择： 　　二氧化碳培养箱的制造商们设计了多种不同的装置去减少和防止污染的发生，其主要是防污染设计和消毒灭菌系统的改进，以达到消毒灭菌的目的。如带有紫外消毒功能的二氧化碳培养箱、带HEPA过滤器净化空气的二氧化碳培养箱，以及带高温灭菌的二氧化碳培养箱等，后者又分为高温干热和高温湿热两类。这些装置的灭菌能力各有千秋，紫外灯消毒范围有限，距离灯越远，或者被遮挡，消毒能力越差。 　　HEPA过滤器的过滤膜孔径有限，无法去除病毒和一些微小细菌，并且容易损耗，也有其局限性。相比而言，高温灭菌则是比较有效的方法。而高温干热和高温湿热也有所不同，不同方法的灭菌效率与温度的高低也有着直接的关系。上海润度生物推出的Herocell系列二氧化碳培养箱可进行140℃的高温干热灭菌，当然也可进行90℃的湿热灭菌，为用户的灭菌方式提供了丰富的可选择性。 　　2、培养工作人员习惯： 　　人为因素和态度可以对环境、人和物起到一个正面或负面的影响。以安全为目的，实验室内的工作人员应明白自身的态度和人为因素对实验环境的重要性。因此，对实验室工作人员进行专业培训对防污染有着重要作用。 　　3、重视管理： 　　细胞室内的二氧化碳培养箱应由专人负责管理，定期对系统进行校正，至少每年一次。各项数值一旦固定后，不要随意调节，以免影响箱内温度、湿度、CO2浓度的波动，降低机器的灵敏度，同时还会影响二氧化碳培养箱内的细胞生产状态。 　　使用前，对二氧化碳培养箱的各项指标进行系统校正，并且对箱体和内部进行消毒处理，等各项数值稳定一段时间后方可使用。一旦出现紧急问题，应及时上报，应由专业的人员进行操作，马上采取应对措施，以免造成不必要的损失。 　　4、规范操作： 　　二氧化碳培养箱的使用虽然很简单，但同样需要规范操作。进细胞室必须穿着实验服，换上拖鞋或者穿一次性的鞋套。实验操作时必须带一次性手套，特别是打开二氧化碳培养箱前，必须先用75%的酒精喷壶喷洗双手再开二氧化碳培养箱，再取出细胞培养瓶或培养板。显微镜下查看细胞培养瓶或培养板后，再放回二氧化碳培养箱时，同样也要喷酒精消毒。 　　二氧化碳培养箱的两个门开关取(放)物要迅速，不可长时间开着，否则会影响CO2的浓度、温度和湿度，以及造成污染。尤其是不要忘了关好里层的玻璃门。切记开门时不要对着二氧化碳培养箱说话，大口呼吸或打喷嚏。 　　5、加强防护： 　　如果实验人员生病而携带病菌，应带上口罩再进细胞室，病情严重的则不宜进行实验。女性同志实验时头发应梳起，防止皮屑污染及连带事件的发生。如果实验室条件允许，可以每人佩戴实验帽、手套和口罩，以防污染二氧化碳培养箱及对实验人员的自身的防护。 　　6、注重保养： 　　二氧化碳培养箱置于细胞室中，室内需保持干燥，环境温度不能超过30℃（建议保持在18℃-30℃）。二氧化碳培养箱放置在远离门窗、供暖设备和空调导管的地方，不能被阳光直接照射。二氧化碳培养箱的放置台面必须水平避震且非易燃材质，不能靠在墙壁或类似的建筑物上，其后部接电处和墙壁至少保留30cm的空间。一旦放好不宜再移动。 　　7、校正处理： 　　二氧化碳培养箱在放好后，再对箱体和内部进行消毒处理，并且对各项指标进行系统校正，等各项数值稳定一段时间后方可使用。因CO2气体对于健康是有害的，因此细胞室需安装足够的通风装置。空气中的粉尘气溶胶易造成二氧化碳培养箱的污染，需要一个流通的空气环境。将二氧化碳培养箱的管理任务分派给有经验的检查人员是十分重要的。如长期不使用二氧化碳时，应将CO2开关关闭，防止CO2调节器失灵，避免给实验室带来安全性事件。 二氧化碳培养箱清洁、消毒、灭菌处理 　　1、二氧化碳培养箱的清洁 　　清洁是指去除灰尘、污垢和有机污渍。清洁方法包括刷、吸、干擦、洗涤或用浸泡肥皂水或清洁剂的湿布拖擦。粉尘、污物以及有机物是微生物的栖身之所，并可能影响除污染剂(抗菌剂、化学杀菌剂以及消毒剂)的作用。 　　二氧化碳培养箱必须先经过清洁才能实现消毒和灭菌的目的，许多杀菌剂只对经过清洁过的物品才具有杀菌活性。清洁时必须使用与以后使用的消毒剂或杀菌剂化学性质上相容的试剂进行清洁、消毒。 　　①清洁箱体表面：先拂去表面的灰尘，再用湿的海绵或软布清洗，再用软布擦干。如果有污物则用低浓度的清洁剂清洗，然后擦干。 　　②清洗箱体内部：选择合适的消毒剂。所有的物件和表面必须彻底清洗，然后用无菌水冲洗，再擦干或晾干。 　　③清洗玻璃门：清洗箱内的玻璃门时使用的清洁剂和清洗培养箱内部时使用的相同。然后用蒸馏水漂洗，从而清除残留的清洁剂，最后用软布把门擦干。 　　2、二氧化碳培养箱的消毒和灭菌 　　消毒是指杀死微生物的物理或化学手段，但不一定杀死其孢子。灭菌是指杀死所有微生物，当二氧化碳培养箱内细胞受到污染时则需要采取灭菌措施。一般，在二氧化碳培养箱内细胞没有污染的情况下平均1-3个月彻底消毒一次。最常用的3种消毒灭菌的方式是：液体消毒剂、紫外和加热。 　　①液体消毒剂：选择对二氧化碳培养箱无腐蚀性的液体消毒剂，并且液体消毒剂的消毒效果好坏和很多因素有关。比如：场所的温度、接触时间、pH、穿透能力、有机物的反应。这些因素中的一些很小的变化可能会造成去污剂的效力上大的不同。因此甚至在很有利的情况下，当最终要求必须无菌时，液体去污剂也不是完全可信赖的去污方法。 　　②紫外消毒：一般先用蒸馏水清洗干净后，再用培养箱自带的紫外灯照射一天或者用手提式的紫外灯照射。因被遮挡时或距离远时都会削弱紫外灭菌的效果，因此紫外灭菌方式较为简单，但效果不够理想。 　　③加热：湿热和干热被认为是杀菌最有效的方法。在一般环境下，高压灭菌器加热到121℃快速产生蒸汽是最方便的方法，但是二氧化碳培养箱无法进行高温高压灭菌，只能退而求其次进行90℃湿热灭菌，但90℃因为温度过低，起不到100℃以上水蒸汽所带来的渗透性和高压力效果，所以灭菌效果也大打折扣.而干热140℃-180℃，2-4小时，是较为理想的灭菌方式，可以起到彻底灭菌的作用。 　　除了以上几种方法外，还可以采用联合杀菌的方法，几种消毒灭菌的方法同时使用来达到彻底清洁的效果。 相比而言，高温灭菌则是比较有效的方法。而高温干热和高温湿热也有所不同，不同方法的灭菌效率与温度的高低也有着直接的关系。上海润度生物推出的Herocell系列二氧化碳培养箱可进行140℃的高温干热灭菌，当然也可进行90℃的湿热灭菌，为用户的灭菌方式提供了丰富的可选择性。