农产品中伏马毒素检测方案(二手分析仪器)

杨新磊、刘一颖安捷伦科技(中国)有限公司 使用 Agilent 1260 Infinity Ⅱ液相色谱系统自动化柱前衍生功能实现伏马毒素FB1 和FB2的高通量检测 本方法使用 Agilent 1260 Infinity I液相色谱系统开发出一种用于测定伏马毒素的自动化柱前衍生高通量液相色谱检测方法，并从灵敏度、重现性和线性范围三个方面对该方法的性能进行了考察。该方法利用自动进样器程序进样功能、自动吸取 OPA 衍生试剂和样品，避免了传统柱前衍生过程中人为量取、混合和等待等繁琐操作以及随之引入的误差，确保了批次间实验结果的重现性，有助于实现伏马毒素的高通量检测。通过该方法，FB1和FB2 的检测限可达300 pg/mL 左右，定量限可达1 ng/mL左右，保留时间RSD%均小于0.2%， 10-2500 ng/mL 范围内有良好的线性相关性，相关系数均大于0.9999。 伏马毒素(FUM)是一种强毒性真菌毒素，普遍存在于玉米、小麦、大米等粮食作物中，对动物和人的健康有很大的潜在危害。1993年，伏马毒素被世界卫生组织的癌症研究机构划定为2B 类致癌物(即人类可能致癌物)2. 目前发现的伏马毒素有 FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4 和 FP1等11种，其中主要组分为FB1，已成为继黄曲霉毒素之后的又一研究热点。目前，我国对伏马毒素尚无明确的限量规定，但许多组织、国家已对伏马毒素制订了限量标准。欧盟对伏马毒素：((FB1 和FB2)的总量规定玉米中限量为4 mg/kg3；瑞士规定人类食物中伏马毒素限量为 1 mg/kg^；美国 FDA 规定以玉米为原料的食品中FB的最大限量为 2-4 mg/kg，动物食品为 5-100 mg/kg. 我国颁布的食品安全国家标准中，伏马毒素的液相色谱检测方法包括柱后衍生和柱前衍生两种3。柱后衍生方法分析时间较长，且仪器配置除了一台液相色谱外，还需要一套柱后衍生系统。而柱前衍生方法步骤又非常繁琐，需要先用移液器分别移取 100 pL样品和衍生试济，再加入样品瓶涡旋约30秒，并在2分钟内进样分析，整个衍生时间需要人为控制。而且，为了保证衍生反应时间一致，必须完成一针进样后才能做下一个样品前处理，整个过程需要操作人员全程值守。 本方法在《GB5009.240-2016食品安全国家标准食品中伏马毒素的测定》6中规定的柱前衍生方案的基础上，运用 Agilent 1260Infinity ll 液相色谱系统的程序进样功能，开发出一种自动化柱前衍生的高通量快速分析方法。该方法无需额外配置设备，无需人员值守，具有良好的重现性，而且定量限和检测限指标完全满足各项主要法规的要求。 仪器和设备 Agilent 1260 Infinity Il液相色谱系统，配备如下安捷伦组件： ( - Agilent 1260 InfinityⅡ四元 泵 (部件号 G7111B) ) ( - Agilent 1260 Infinity 标准自动进样器(部件号G7129B) ) ( - Agilent 1260 Infinity 柱温箱(部件号 G7116A) ) ( - Agilent 1260 Infinity 荧光检测器(部件号 G7121B)，配备标准检 测池(8pL) ) 标样配制 将伏马毒素 FB1和FB2标准混合储备液用乙腈/水(50%/50%)逐级稀释为2500、500、250、125、75、25和 10 ng/mL，分别对应于浓度级别7、6、5、4、3、2、1。 表1.标样配制 级别 1 2 3 4 5 6 7 浓度 ng/mL 10 25 75 125 250 500 2500 自动衍生步骤 硼砂溶液和衍生试剂参照《食品安全国家标准食品中伏马毒素的测定》中第三法的规定进行配制。 硼砂溶液(0.1 mol/L)：称取硼砂3.8 g，用水溶解并稀释至100mL， 混合均匀。取该溶液1mL 置于2mL样品瓶中，放在自动进样器的P1-A1位置。 衍生试剂：准确确取 40 mg 邻苯二甲醛，溶于1mL甲醇中，用 5mL 硼砂溶液进行稀释，并加入50 uL2-巯基乙醇，混合均匀。取该溶液100 uL 置于 250 uL内插管中，然后将内插管放入2mL棕色样品瓶中，放在自动进样器的 P1-A2位置。剩余衍生试剂放入-20℃冰箱中冷藏，1周内使用未发现异常。 表2.自动衍生方法设置 功能 参数 抽取 使用默认补偿值以 90 pL/min 从位置“P1-A1”上抽取 5.00 pL 抽取 使用默认补偿值以默认速度从位置“P1-A2”上抽取3.00 pL 抽取 使用默认补偿值以 90 pL/min 从样品中抽取默认体积 清洗 在冲洗口清洗针3s 抽取 使用默认补偿值以90 pL/min 从位置“P1-A2”上抽取 3.00 pL 混合 将来自空气中的10.00pL 以默认速度混合20次 等待 等待0.5 min 清洗 在冲洗口清洗针3s 进样 进样 色谱柱 Zorbax RRHD Plus C18， 3.0×50 mm， 1.8 um 柱温 40°C 进样量 4uL(自动进样器自动衍生) 流动相 A相： 10mmol/LKH2PO4， pH 2.3(HPO调节) B相： MeOH/ACN (50%/50%) 流速： 0.8 mL/min 荧光检测器 激发波长：335，发射波长：440， PMT增益：12，采样频率： 9.26 Hz 梯度时间表 时间 (min) 0 3 6 6.1 9 使用上述方法对伏马毒素FB1和FB2标准样品进行分析，第5级浓度的标准样品分析结果如图1所示。结果表明，采用 Plus C18超高效短色谱柱对衍生产物进行分离，能够在 9 min 内获得良好的分离效果，分离时间较国家标准方法所需的16 min 缩短了近一半。 图1.250 ng/mL伏马毒素标准样品中 FB1 和FB2的分离结果 峰面积和保留时间重现性考察 对第3级浓度(75ng/mL) 的伏马毒素标样进行5次重复分析，以考察峰面积和保留时间的重现性。结果显示FB1和FB2的保留时间 RSD% 均小于0.2%，且峰面积 RSD%均小于1.1%，满足国家标准中两次独立测定结果的差值不超过算数平均值20%的要求，具体结果见表3。之所以能够获得良好的峰面积重现性，主要是由于自动化柱前衍生过程中涉及的样品和溶剂的量取均采用高精度计量泵来实施。而且，整个衍生反应流程一致，时间恒定，从而使得衍生效果稳定，定量结果可靠。 表3.FB1和 FB2的保留时间和峰面积重现性(n=5) 化合物：FBI 信号：FLD1A 行号 样品名称 位置 进样次数 类型 保留时间[min] 含量 浓度[ng/mL] 峰面积 24 75ng/mL PI-C-04 1 BB 4.315 73.6137 73.6137 8.587 25 75 ng/mL PI-C-04 1 BB 4.324 74.2227 74.2227 8.662 26 75 ng/mL PI-C-04 1 BB 4.332 75.1531 75.1531 8.776 27 75 ng/mL PI-C-04 1 BB 4.322 73.8910 73.8910 8.621 28 75 ng/mL PI-C-04 1 BB 4.332 75.1692 75.1692 8.778 平均值 4.325 74.4099 74.4099 8.685 标准偏差0.007 0.7189 0.7189 0.088 RSD 0.166 0.9661 0.9661 1.014 化合物： FB2 信号：FLD1A 行号 样品名称 位置 进样次数 类型 保留时间min 含量 浓度[ng/mL] 峰面积 24 75 ng/mL PI-C-04 1 BB 5.943 75.1060 75.1060 7.951 25 75 ng/mL PI-C-04 1 BB 5.941 75.5827 75.5827 8.004 26 75ng/mL PI-C-04 1 BB 5.935 75.4930 75.4930 7.994 27 75 ng/mL PI-C-04 1 BB 5.939 75.2154 75.2154 7.963 28 75 ng/mL PI-C-04 1 BB 5.965 75.4065 75.4065 7.985 平均值 5.945 75.3607 75.3607 7.980 标准偏差0.012 0.1968 0.1968 0.022 RSD 0.199 0.2611 0.2611 0.274 线性范围考察 依次将不同浓度的标准样品按浓度从低到高进样，每个浓度点进样三次，以浓度为横坐标、每个浓度下 FB1 和FB2峰面积的平均值为纵坐标绘制标准曲线，结果如图2所示。无论是在低浓度范围(10-500 ng/mL) 还是在高浓度范围(10-2500 ng/mL)，FB1和FB2均获得了良好的线性相关性，相关系数均大于 0.9999. 图 2.FB1和FB2的低浓度范围(10-500ng/mL，A和C)和高浓度范围(10-2500 ng/mL， B和D)标准曲线 灵敏度考察 对第1级浓度(10 ng/mL) 的标样进样分析以考察方法的灵敏度。结果如图3所示。在该浓度下， FB1的信噪比为94， FB2的信噪比为143。由此推断， FB1 和FB2的检测限可达 300 pg/mL左右，定量限可达1 ng/mL 左右；而国家标准中指出，当称样量为5g时， FB1、FB2的检测限分别为 17 pg/kg、8 ug/kg， 定量限分别为 50 pg/kg、25 ug/kg。因此，本方法完全满足国家标准方法要求。 图3.10 ng/mL 伏马毒素标样中FB1 和FB2的分离结果 本研究使用 Agilent 1260 Infinity lI 液相色谱系统的程序进样功能，对伏马毒素FB1 和FB2 进行自动衍生，可有效防止 FB1和FB2衍生产物的降解。与国家标准方法相比，该方法可大幅提高检测效率，降低实验室人工成本。并且该方法具有非常良好的灵敏度、线性和重现性，检测结果可靠，是一种非常适合于大批量样品高通量分析的方法。 ( 1. 1 W .J. Kong，et al. Analysis of fumonisins B1 an d B2 in s picesand a romatic and medicinal herbs by HPLC-FLD with on-linepost-column derivatization a n d positive confirmation by LC- MS/MS. Analyst， 2012，137：3166-3174 ) ( 2.1 K . C .Piancentini， et al. Mycotoxin analysis of industrial beersfrom Brazil： The i nfluence of fumonisin B1 and deoxynivalenol in beer qualit y . Food Chem. 2017，218： 6 4-69 ) ( 3. SENYUVA Hamide， et al. Determination of Fumonisins B1 andB2 i n Corn by LC/MS with I mmunoaffinity Column Cleanup： Interlaboratory Study.JOURNAL OF AOAC I NTERNATIONAL 2010，93，611 - 621 ) ( 4. Ildiko'Barna-Vetro'， et al. Development of a s e nsitive ELISA forthe de termination of fumonisin B1 i n cereals. J Agric Food Chem. 2000， 48，2821-2825 ) ( 5. USFDA. Draft guidance for industry： fumonisin levels in human foods and animal feeds. 2006 ) ( 6. GB5009.240-2016食品安全国家标准食品中伏马毒素的测定 ) 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( C安捷伦科技(中国)有限公司，2018 ) ( 2018年12月25日，中国出版 ) 本方法使用 Agilent 1260 Infinity II 液相色谱系统开发出一种用于测定伏马毒素的自动化柱前衍生高通量液相色谱检测方法，并从灵敏度、重现性和线性范围三个方面对该方法的性能进行了考察。该方法利用自动进样器程序进样功能、自动吸取 OPA 衍生试剂和样品，避免了传统柱前衍生过程中人为量取、混合和等待等繁琐操作以及随之引入的误差，确保了批次间实验结果的重现性，有助于实现伏马毒素的高通量检测。通过该方法，FB1 和FB2 的检测限可达 300 pg/mL 左右，定量限可达 1 ng/mL 左右，保留时间 RSD% 均小于0.2%， 10–2500 ng/mL 范围内有良好的线性相关性，相关系数均大于 0.9999。