水溶液中溶剂残留检测方案(自动进样器)

使用安捷伦7697A 顶空进样器进行 USP<467> 溶剂残留的高精度分析 应用简报 制药 作者 摘要 Roger L. Firor 安捷伦科技公司 2850 Centerville Rd Wilmington， DE 19808-1610 USA 安捷伦7697A顶空进样器与 7890 GC联用，测定水溶液中限值浓度的 UPS <467>1级和2级溶剂残留。1级、2A级和2B级溶剂的精密度通常为 RSD% 小于 2.5%。研究分别对分流/不分流进样口和挥发性物质分析接口配置进行了测试。每种进样口均使用了 10 mL和 20mL的样品瓶。顶空控制软件完全整合到多技术软件平台化学工作站中，用于方法开发和最终分析。另外，文中还对使用 FID-FID 和 FID-MSD 进行双柱残留溶剂确认进行了阐述。 Agilent Technologies 前言 药物的溶剂残留分析对于保护病人安全非常重要。质量保证 (QA)实验室室规使用美国药典 (USP) 方法 <467>进行分析[1]。基本的气相色谱/静态顶空方法在世界范围内广泛用于质量控制，该方法严格遵循 ICH Q3C 指南。 药物的溶剂残留可能来源于活性药用成分 (API) 或者最终产品的生产过程。由于残留溶剂可能影响药物的安全性、结晶型、溶解性、生物利用率和稳定性等诸多方面，有必要对残留溶剂进行监测和控制。所有原料药，赋形剂和产品都需要进行监测。 除了为节约样品分析时间和循环时间而改变了样品瓶平衡时间和GC 柱箱升温速率外，其他参数均遵循 USP <467> 指南。可以使用 USP专论中的方法，但需要与原版 USP 方法进行比较和验证。每个等级的溶剂分开运行，因此，可以使用时间更短的 GC柱箱升温程序。 USP<467>为1级和2级残留溶剂检测规定了以下三种操作程序： 1.操作程序A：鉴定及限值检测 2. 操作程序B：验证测试(溶剂是否超过限值) 3. 操作程序C：定量检测 操作程序A使用固定相 G43(本研究使用安捷伦624色谱色， VF-624ms 或者 DB-624 色谱柱，部件号：123-1334)，操作程序B使用 G16 固定相 (HP-INNOWax柱，部件号：9091N-113)。一般情况下，在其中一种固定相中共流出的组分在另一种固定相中不会共流出。既然该研究的主要目的是对重现性进行评估，那么只使用624色谱柱普算 RSD 值。文中对其他使用双 FID (624 和NNOWax 柱)或者 FID/MSD 的设置也进行了说明。 历史的经验证明，静态顶空方法在分析浓度与 USP 467 限值相当或者更低的溶剂时，存在重现性差的弊端。和上一代进样器相比， 7697A顶空进样器使先进气气动设计、卓越的加热控制模块和精确的计时系统，提高并改善了残留溶剂测定的重现性和精密度。 实验 本研究采用 USP <467>操作程序A验证 7697A的性能。7890GC 配置分流/不分流进样口和挥发性物质分析接口。分流/不分流进样口使用一个2mm 的脱活直形衬管(部件部：5181-88180)，使用4mm 直形衬管(部件号：210-3003)同样可获得优良的结果。 配制1级、2A级和2B级溶剂限值浓度的水溶液。无有机物的干净的实验用水对成功的标准品配制非常重要。各等级溶剂按最终浓度配制 250mL 的溶液。然后使用与500mL 玻璃瓶连接的Brand分液器， 各取6mL配好的溶液至10mL或者20mL 的样品瓶中。只允许许用 Teflon 涂层的顶空瓶密封垫。不向样品瓶中加入盐。安捷伦残留溶剂标准品的部件号为： 1级：5190-04902A级：5190-04922B级：5190-0513 7697A通过 0.45mm 内径的脱活熔融石英毛细管 (Restek Siltek，部件号10018)与进样口相连，石英毛细管在分流/不分流进样口通过隔垫进入入 2mm 脱活的直形衬管中。对于挥发性物质分析接口， 使用 SilTite 金属密封垫圈和特制的内部螺母(专为ⅥI设计)将熔融石英毛细管直接连接到接口。分析使用|30米长0.32mm 内径的色谱柱，该色谱柱兼具良好的分离度、较快的分离速度、较大的容量并且方便使用。根据需要，也可以使用窄径毛细管色谱柱以提高分辨率。 样品瓶压力由 7697A上的气动控制模块 (PCM) 来控制， 而载气从进样口EPC 到顶空进样器再回到7890 的进样口。用户可通过每次运行间的吹扫功能设置优化排气路径使溶剂凝结最小化。顶空样品环容积为1ml，使用氦气做载气和样品瓶加压气。样品瓶压力通过 PCM 设置为无需校准的“标准温度和压力”(NTP)下的值，这样的绝对压力模式可以获得一致性的结果，不受不同地理位置的压力和温度不同的影响。 系统示意图如图1所示。表1中列出了此应用中各参数的设定。 图1. 重现性研究使用的系统示意图 表1. 剂残留分析的系统参数 7697A 样品瓶进样程序由以下13步组成： 分流/不分流 140°C 挥发性物质分析接口 145°C 载气控制 进样口EPC 进样口 EPC 顶空传输管线 脱活 0.45 mm熔融石英毛细管 色谱柱 p/n CP9104 30m×0.32mmx1.80 um VF-624 ms 柱箱升温程序 40℃ (5 min) 到 240 °C (2 min)， 18℃/min 顶空区域温度 顶空温度 85°C 阀/样品环 85°C 传输管线 100°C 样品瓶采样参数 10 mL 20 mL 样品环规格 1mL 1mL 样品瓶平衡时间 40 min 40 min 进样时间 0.5 min 0.5 min 样品瓶加压值 15 psia (NTP) 15 psia (NTP) 样品瓶最终进样压力 0(常温常压) 10 psia (NTP) 压力平衡时间 0.10 min 0.10 min 样品瓶终压保持时间 0.05 min 0.05 min 样品瓶充气速率 50 mL/min 50 mL/min 样品瓶升压速率 20 psi/min 20 psi/min 提取后样品瓶放空 是 样品瓶震荡设置 2 1待机23 样品瓶预加压 流量传感器自动调零 4. 样品瓶恒流加压 5样品瓶恒压加压68 样品瓶压力平衡 样品环填充(样品瓶排气) 样品瓶全量排气注射 9. 样品瓶非全量排气注射 10.样品瓶归位 11.样品瓶移离进样针 复原(吹扫进样针和排气管线) 复原(吹扫进样针) 这些 EPC 控制步骤使用户能够以简洁、可重复的方式全程控制样品瓶顶空进样，并且最大程度地减少溶剂残留。EPC 模式还具有大气压力补偿功能，参数设置可通过 7697A 的键盘或者顶空控制软件完成。除了具备独特的顶空自动进样控制功能外，软件的其他功能非常接近标准液体自动进样器软件。待机状态和注射步骤的气路图分别如图2和图3所示。 顶空进样系统气路控制图，待机状态 图2. 待机模式下， PCM EPC 进入流量控制模式，以限制待机状态下的气体消耗量。气流对样品管线、6通阀、电磁阀 (SV1)、浓缩管和进样针进行冲洗。载气从GC 进样口 EPC流经6通阀和传输管线，再回到 GC 进样口。图中未明示进样口分流管线气路 样品环填充(样品拼排空) 图3. 样品气流从加压的样品瓶到排空的路径。由 PS1 和PV2组成的反压调节阀通过样品瓶部分的 PCM EPC 模块2号通道控制调节绝对出口压力，降低排空气流，从而使样品量更准确 ChemStation 完全整合了7697A的控制功能，主要参数输入界面 如图4所示： 图4. 20mL样品瓶加压到 15psi (NTP)， 然后以 20 psi/min 放空到 10 psi (NTP) 的参数设置 表2列出了所有1级，2A级和2B 级溶剂在 USP<467>限值浓度水平的 RSD 值。每个等级溶剂不同配置下各运行20次。每个等级试剂以不同配置运行前，先运行两个样品空白。从表中可以看出，共进行了四种配置的测试：10ml、20ml样品瓶的分流/不分流进样口进样和10ml、20ml样品瓶的挥发性物质进样口进样。 不考虑样品瓶规格和进样模式，大式数 RSD 远低于 2.5%。而进行压力平衡或者采用传统的阀和样品环系统，无法得到如此高的可重复性 (RSD)。那些 RSD 值相对较高的溶剂通常具有较低的分配系数k(亲水性较差的极性溶剂)或者在 USP 限值浓度水平的检测器响应较低，如硝基甲烷。不同的样品制备对低分配系数的溶剂影响较大，其他溶剂系统，如 DMSO、DMAC、DMI 或者 DMSO 和水的混合物，会显著改变信号响应，然而，若以水做溶剂，其 RSD 值将与本研究的 RSD 值相当甚至更好。 安捷伦 7697A 的排空控制可以使用户灵活设置填充样品环时样品瓶的最终压力。对于方法开发来说，样品瓶的最终压力一般应设在 2.0 psi (NTP) 和 10.0 psi (NTP) 之间，这样可得到最佳的重复性。7697A的排空控制可以确保更好的结果，并且依分析物的分配系数K不同，还可以提高分析的灵敏度。7697A 的样品瓶加压有三种模式：流量限制压力模式；200 mL/min 压力控制模式；固定容积模式。本研究采用了流量限制压力模式。 图5为三种级别的溶剂典型的色谱图。值得注意的是，在安捷伦VF-624 ms 色谱柱上，1级溶剂苯和1，2-二氯乙烷可以实现基线分离。 表2. 限值浓度水平的溶剂残留 RSD 实验结果列表。均以水为溶剂进行标准品制备。n=20 图5. USP 467 限值浓度水平的1级、2A级和2B级溶剂色谱图分别见图A、B、C。所有均使用分流/不分流进样口和20mL 样品瓶 附加配置 按图66结构所示，可以进行安捷伦 VF-624ms 色谱柱和INNOWax 色谱柱的同步双柱分析。脱活的保留间隙柱将进样口和一个不吹扫分流器相连，样品流按1：1分配比同时在 30 m ×0.32 mm 624 色谱柱和 INNOWax 色谱柱上运行，因此UPS<467>的方法A和方法B可同时完成。该配置只需用 SilTite 内螺母堵住 CFT分流器的一个出口即可轻易转换成单色谱柱配置，如图6方框中所示。 1级、2A级和2B级溶剂色谱图示例分别见图7、图8和图9.仪器条件：挥发性物质接口7：1 分流比， 14psi， 40℃；柱箱，初始温度40℃保持5min， 以 18℃/min 升至240℃，保持2min。限值浓度水平所有三种级别溶剂的色谱图见图10。 图6. 双色谱柱配置。方框中为使用分流器配置单色谱柱 图7. USP 467 限值浓度水平1级溶剂的双色谱柱分析 图8. USP 467 限值浓度水平的2A级溶剂的双色谱柱分析 图9. USP 467 限值浓度水平2B级溶剂的双色谱柱分析 图10.所有级别溶剂的双色谱柱分析。挥发性物质接口5：1分流比；柱箱，初始温度35℃保持 17min， 以20℃/min 升至240℃，保持5min 624色谱柱化合物出峰标号： 1.甲醇2.1，1，-二氯乙烯3乙腈4.二氯甲烷5.反式-1，2二氯乙烯6.己烷7.顺式-1，2二氯乙烯，硝基甲烷8.四氢呋喃9.氯仿10.环己烷，四氯化碳，1，1，1-三氯乙烷11.苯12.1，2-二氯乙烷13.1，2-二甲氧基乙烷14.三氯乙烯15.甲基环己烷16.1，4-二氧六烷17.吡啶18.甲苯19.2-己酮20.氯代苯21.乙苯22.间/对二甲苯23.邻二甲苯24.四氢萘 INNOWax 色谱柱化合物出峰标号： 1.乙烷2.环己烷，甲基环己烷，1，1二氯乙烯3.反式-1，2二氯乙烯， THF， 1，1，1-三氯乙烷四氯化碳4.甲醇，1，2-二甲氧基乙烷5.二氯甲烷，苯6.顺式-1，2二氯乙烯，三氯乙烯7.乙腈8.氯仿9.甲苯10.1，4-二氧六烷11.1，2-二氯乙烷12.2-己酮13.乙苯14.对二甲苯15.间二甲苯16.硝基甲烷(此坐标轴标尺下不可见) 当所有 USP 1 级和2级溶剂混合出峰时，在624色谱柱和INNOWax 色谱柱上都有共流出现象。但鉴于许多共流出化合物在两相中的不同表现，双柱分析可得到更明确的鉴定结果。而且，在实际分析中，往往只对更少的溶剂进行分析，更有利于准确鉴定。 对于新药开发和质量控制， FID 和 MS 的双通道配置可以作为溶剂残留分分的强大工具。使用安捷伦 5975C MSD 的配置图如图11所示，该系统尤其适用于无需无从 USP <467> 指南的一般性方法的开发。MSD 分析可以避免药品生产中涉及的60多种溶剂分析的不确定性，当出现未知峰或者未知溶剂时，该系统是溶剂识别和定量的最佳解决之道。由于存在检测器分流和使用补偿气流，该系统在灵敏度上会有所降低。。(表3) 在该配置中，必须仔细调节限流阀的大小，以避免最大柱箱温度下， Aux EPC 补偿气信号通道出现 “not ready”状态。这一状况通常发生在限流过大，气流在 Aux 通道中发生逆流的时候。补偿气压在整个系统中必须为正的。表3为不同温度下的流量计算。使用流量计算公式[2]计算需要的流量。 表3. 图10所示配置的流量 (mL/min) 计算 柱箱温度 色谱柱流速 MSD**流量 FID流量 总流量 补偿气流量 40°C 8.1 4.6 150°C 5.1 1.6 240°C 3.5 1.9 1.9 3.8 0.3* *最大柱箱温度下，如果补偿气流为负值， Aux EPC 就会出现"not ready"指示，必须要避免这种情况。必要时检查并调节限流阀 ( ** 流量考虑了220℃下，17.1 cm 限流阀的作用(MSD 传输管线) ) 图11. FID-MSD 的双通道配置，限流阀 (分流到FID)=80 cm x0.20mm， 限流阀 (分流到 MSD)=137 cmx0.18 mm DB-624 色谱柱30mx 0.32 mm x 1.80 pm 某些溶剂在 FID 上的响应小于 MSD， 比如1，4-二氧六烷和2-己酮表现出更高的 MSD 信号，对那些信噪比很低或者共流出的化合物，使用提取离子或者 SIM 可以很大程度地提高测定的准确率。 Time-> 结论 ( 安捷伦 7697A 顶空进样器在分析溶剂残留方面具有卓越的重现 性。全惰性样品流路、误差±0.1℃以内的稳定的加热模块和灵 活的 EPC 样品瓶进样绝对压力控制系统均体现了仪器优异的性能。 ) ( 所有配置中几乎均无溶剂残留。流量和时间事件的程序化设计可 以在运行间隙对进样针和排空管线进行有效的吹扫和清洗。 ) 本文中的方法和配置阐述了用于残留溶剂分析的大量可行的策略。实验室和 QA 部门应该根据 USP 和ICH指南进行系统适应性研究和方法验证。FID-MSD 系统尤其适用于药物配方未知的溶剂分析，此外，该配置还可通过 SIM 解决分析物共流出的问题。 ( 参考文献 ) ( 1. USP 32-NF 27， General Chapter USP <467> Organicvolatile impurities， United States Pharmacopeia.Pharmacopoeia Convention Inc.， Rockville， MD， 8/2009 ) ( 2. 从 w ww.agilent.com/chem/flowcalculator 下载 “GC Pressure F low Calculator Software Revision 2.05" ) 3. Albert E Gudat and Roger L. Firor， "Improved RetentionTime，Area Repeatability， and Sensitivity for Analysis ofResidual Solvents，" 安捷伦科技出版物 5989-6079CHCN 更多信息 有关我们产品和服务的更多信息，请访问 www.agilent.com/chem/cn。 www.agilent.com/chem 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 @安捷伦科技(中国)有限公司，2011 2011年3月15日，中国印刷 5990-7625CHCN Agilent Technologies 安捷伦 7697A 顶空进样器与 7890 GC 联用，测定水溶液中限值浓度的 UPS <467> 1 级和 2 级溶剂残留。1 级、2A 级和 2B 级溶剂的精密度通常为 RSD% 小于 2.5%。研究分别对分流/不分流进样口和挥发性物质分析接口配置进行了测试。每种进样口均使用了 10 mL 和 20 mL 的样品瓶。顶空控制软件完全整合到多技术软件平台化学工作站中，用于方法开发和最终分析。另外，文中还对使用 FID-FID 和 FID-MSD 进行双柱残留溶剂确认进行了阐述。