盐酸平阳霉素中氯离子检测方案(二手分析仪器)

中国抗生素杂志2015年7月第40卷第7期.523. 离子色谱法测定盐酸平阳霉素中的氯离子 杨倩等.524. 离子色谱法测定盐酸平阳霉素中的氯离子 杨倩 袁雯玮 (天津市药品检验所，天津300070) 摘要：：目的 建立离子色谱法测定盐酸平阳霉素中的氯离子含量，推测其成盐比例。方法 采用Dionex IonPac AS11-HC(250mm×4mm， 5pm)为色谱柱， 以20mmol/L氢氧化钠溶液为淋洗液，流速为1.0mL/min， 柱温为30℃，检测池温度为35℃，抑制性电导检测器的抑制电流为100mA；测定3批盐酸平阳霉素中氯离子的含量，换算出盐酸含量，并进行了方法学验证。结果 在2~30ug/mL浓度范围内，氯离子溶液的峰面积与其浓度呈良好的线性关系(r=1.0000)，加样回收率分别为98.6%、99.5%和99.5%； RSD分别为0.82%、0.21%和0.45%(n=3)，3批盐酸平阳霉素中氯离子的含量折算成以盐酸计，平均含量为6.83%。结论本研究建立的离子色谱法操作简单，线性范围、重复性、回收率好，能适用于测定盐酸平阳霉素中氯离子含量，进而得到平阳霉素与盐酸成盐比例为1：3。 关键词：盐酸平阳霉素；氯离子含量；离子色谱；成盐比例 中图分类号： R978.1*9 文献标志码： A Determination of chloridion in bleomycin A. hydrochloride by ion chromatography Yang Qian and Yuan Wen-wei (Tianjin Institute for Drug Control， Tianjin 300070) Abstract(Objective To establish a method to speculate the salt-forming proportion in bleomycin A， by ionchromatography. Method A Dionex IonPac AS11-HC (250mm×4mm， 5pm) column was used. The elutriantwas 20mmol/L sodium hydroxide solution. The flow rate was 1.0mL/min. The column temperature was set at30℃. Inhibitory electrical detector was used with detecting pool temperature of 35℃.The chloride contents in 3lots of bleomycin A， hydrochloride were analyzed and converted to the content of hydrochloride. The method wasvalidated adequately. Results The calibration curve was linear in the range of 2~30pg/mL for concentration ofchloride(r=1.0000). The spiked recoveries were 98.6%， 99.5% and 99.5%， and the RSDs were 0.82%， 0.21% and0.45%(n=3). The average content of hydrochloride in 3 lots of samples was 6.83%. Conclusion The method issimple， linear， accurate，precise and suitable for the determination of chloride content in bleomycin A， hydrochloride.The salt-forming proportion in bleomycin A5 hydrochloride is 1：3. Key words Bleomycin A， hydrochloride； Content of chloride； Ion chromatography； Proportion of salt-forming 平阳霉素是由我国自主研发的博来霉素类抗肿瘤抗生素，其化学结构为博来霉素A，组分(图1)。该药对多种癌症有效，且无常用抗癌药物所引起的白细胞减少症状，也不抑制机体的免疫功能，肺毒性低于博来霉素。1994年进入首批国家基本药物目录并收载于《中国药典》。平阳霉素结构中含有多个氮原子，临床上以盐酸盐形式存在，其成盐比例与缓冲液的pH值有关。在《中国药典》2010年版收载的盐酸 平阳霉素项下，盐酸的成盐比例以1：n表示即，目前未见有文献报道平阳霉素的成盐情况。鉴于抗生素品种含量通常以活性成分(API)计，其含量限度的确定，应考虑分子中含酸根离子或盐的量等因素。 20世纪70年代发展起来的离子色谱法适合于阴、阳离子等各种离子及有机酸碱的分析，方法简便、灵敏，选择性好图。本研究建立了离子色谱法测定盐酸平阳霉素中的氯离子含量，进而确定其成盐比例。 ( 收稿日期：2014-09-10 ) ( 作者简介：杨倩，女，生于1 9 82年，主管药 师 ，主要从事抗 生 素类药品质量标准研究， E-mail： ya n gqian0111@163.com ) 仪器与试药 Dionex ICS 3000离子色谱仪(美国Thermo公司)，ASRS-4mm抑制器(美国Thermo公司)， Milli-Q超纯水系统(18.2MQ/cm3， 25℃， 美国Millipore公司)，Mettler Toledo XS 205 型电子分析天平(瑞士Mettler公司)。 盐酸平阳霉素(天津太河制药有限公司，批号：100202、121201、130101)，氯根离子溶液标准物质(浓度以Cl计为1000ug/mL， 中国计量科学研究院，批号：14013)，氢氧化钠溶液(50%~52%，离子色谱专用， Fluka Sigma-ALDRICH)， 氯化钠、亚硝酸钠、氟化钠、硝酸钠、硫酸钠、磷酸氢二钠、溴化钾和溴酸钾(均为分析纯，天津市化学试剂一厂)，水为超纯水。 2方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱： Dionex IonPac AS11-HC(250mmX4mm，5um)， 预柱： Dionex IonPac AG11-HC(50mm×4mm，5um)； 以20mmol/L氢氧化钠溶液为淋洗液，等度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测池温度：35℃； 进样量： 50pL；以抑制性电导检测器进行测定，抑制电流： 100mA，外接水模式，式气压力27.6kPa。 2.2 溶液的制备 2.2.1 标准溶液 精密量取10mL氯根离子标准溶液(1000pg/mL)，置100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为标准储备液。精密量取储备液5mL， 置50mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液。 2.2.2 供试品溶液 取盐酸平阳霉素约15mg，精密称定，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(浓度为0.15mg/mL)。 平阳霉素结构式 Fig. 1 Structure of bleomycin A 2.3 专属性试验 分别取氯化钠、亚硝酸钠、氟化钠、硝酸钠、硫酸钠、磷酸氢二钠、溴化钾和溴酸钾适量，精密称定，加水溶解并稀释制成浓度各约为10pg/mL的混合离子溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。在该色谱条件下，其他离子能与氯离子可较好分离，该法专属性良好，见图2~3。 2.4 线性关系考察 分别精密量取“2.2.1”项下的标准储备液2、5、、10、15、20和30mL置100mL量瓶中，加水稀释至刻度。按“2.1”项下色谱条件测定。结果表明，在2~30pg/mL浓度范围内，氯离子溶液的峰面积与其浓度呈良好的线性关系，线性方程为Y=1.1119X-0.1894，r=1.0000。 2.5 最低检出限 精密量取线性关系考察中的标准溶液适量用水稀释至一定浓度后测定，氯离子的最低检出浓度为4ng/mL(S/N>3)，相当于盐酸平阳霉素的0.0025%。 2.6 精密度试验 取同一份标准溶液，按“2.1”项下色谱条件连续重复进样6次，记录氯离子峰面积，计算RSD=0.63%。 2.7 重复性试验 取盐酸平阳霉素样品(批号：： 121201)约15mg，精密称定，分别按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件重复测定，计算氯离子的含量，平均含量为6.98%， RSD为0.71%。 2.8 回收率试验 图2 混合离子溶液色谱图 Fig.2Chormatogram of the mixed ion solution 200 图3 供试品溶液色谱图 Fig.3 Chormatogram of the test solution 采用加样回收率试验测定准确度。取已知氯离子含量的盐酸平阳霉素(批号：121201)约15mg，精密称定，置200mL中，分别精密加入氯根离子标准溶液(1000ug/mL)0.5、1和2mL，用水稀释至刻度。每个浓度平行操作3次，按“2.1”项下色谱条件测定，以测得量和加入量计算回收率，结果低、中、高3个浓度的平均回收率分别为98.6%，99.5%和99.5%；RSD分别为0.82%，0.21%和0.45%。 2.9 稳定性试验 取盐酸平阳霉素样品(批号：121201)约15mg，精密称定，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，室温静置，分别于0、1、2、4、8、16和24h按“2.1”项下色谱条件，进样测定，记录氯离子峰面积。结果表明供试品溶液24h内基本稳定，氯离子峰面积的RSD为1.1%(n=7)。 2.10 样品测定 取3批盐酸平阳霉素样品，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件测定，计算氯离子的含量，再折算成盐酸的含量，结果见表1。 2.11 盐酸平阳霉素中成盐比例的确定 平阳霉素结构中含有多个氮原子，成盐的可能性依次为伯胺或仲胺、酰胺、芳香胺等。采用ACD/I-Lab 2.0版软件分析平阳霉素的理论pKa值并结合含氮有机化合物成盐规律，如果按照《中国药典》对该品种酸度的控制要求，即pH值应为4.5~6.0，理论推测可能存在3~5个成盐位点(图1中标出的位置)，当pH=4.5时，主要形成4个盐酸盐；当pH=6.0时，主要形成3个盐酸盐。已知平阳霉素(C，H，NOS，MW1440.6)和盐酸的分子量(MW 36.5)，可以计算得到盐酸平阳霉素中含有n个盐酸时的理论盐酸含量(表2)。3批样品中盐酸的含量在7.18%~6.63%之间，平均含量为6.83%，则盐酸平阳霉素的成盐比例应为1：3，样品的pH值越低，其盐酸的含量越高。若将盐酸平阳霉素的成盐率控制在理论值的90.0%~110.0%，则盐酸的含量限度应为6.4%~7.8%。 3讨论 3.1 盐酸平阳霉素的含量 根据本研究结果，如盐酸平阳霉素的成盐比例为1：3，得到盐酸的理论含量为7.06%，样品实测值为6.83%。由此可知，目前国内样品中盐酸平阳霉素成盐比例应为1：3，以活性成分平阳霉素计，其理论含量为92.9%。 表1 氯离子测定结果 Tab.1 Results of content of Cl in bleomycin A. Batch No. 100202 6.50 6.68 5.4 121201 6.98 7.18 5.1 130101 6.45 6.63 5.5 盐酸含量=氯离子含量×36.5/35.5 表2 盐酸平阳霉素中盐酸及平阳霉素理论含量 Tab.2 Theoretical content of hydrochloric acid and bleomycinA， in Bleomycin A， hydrochloride Salt-forming Relative molecular The theoretical The theoretical proportion weight of bleomycin content of content of between As hydrochloride hydrochloric bleomycin A5% hydrochloric acid acid/% and bleomycin A， 1477.1 2.47 97.5 1513.6 4.82 95.2 1550.1 7.06 92.9 1586.6 9.20 90.8 1623.1 11.2 88.8 1659.6 13.2 86.8 3.2 成盐比例控制 盐酸平阳霉素自上世纪70年代生产至今，经验表明将成盐缓冲液的pH值控制在4.5~6.0的范围，样品质量稳定，有关物质较少且该pH值符合临床上对注射剂pH值的要求。通过本实验的研究可知，在现行药典标准规定的pH值范围内，基本可以控制平阳霉素的成盐比例。成盐比例稳定，盐酸平阳霉素活性成分的含量就更为可控。 3.3 混合离子溶液的选择 离子色谱中无机阴离子的保留行为受到离子价态、离子半径及离子的极化程度等多种因素的影响。本文所述的实验条件下，可实现C1与FNO，、SO 2、NO，、PO3等常见阴离子的有效分离， 其中Cl与BrO，色谱峰最为接近， 但BrO，并非常见离子且样品中未检出除Cl外的其他阴离子，故该色谱条件可以适用于盐酸平阳霉素中Cl的测定。 ( 参考文献 ) ( 1] 甄永苏，李电东 . 抗肿瘤抗生素平阳霉素研究与临床应用 40年[J] . 中国抗生素杂 志 ，2009，34(10)：577-580. ) ( ] [2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S](二 部) . 北 京： 中国医药科技出版社，2010：659-660. ) ( [ 3 ] 张培敏，周琰春，朱岩.离子色谱在制药分析中的新进展 [J].药物分析杂志，2007，27(1)： 1 5 1-155. ) ( [4] 李娅萍，陈汝贤，杨娅莉，等.确定盐酸博宁霉素中成盐比例[J].中国新药杂志，2013，22(22)：2616-2621. ) 数据 建立离子色谱法测定盐酸平阳霉素中的氯离子含量，推测其成盐比例。方法：采用DionexIonPacASll-HC（250mmX4mm,5μm）为色谱柱，以20mmol/L氢氧化钠溶液为淋洗液，流速为l.OmL/min,柱温为30℃，检测池温度为35℃，抑制性电导检测器的抑制电流为lOOmA;测定3批盐酸平阳霉素中氯离子的含量，换算出盐酸含量，并进行了方法学验证。结果：在2-30?g/mL浓度范围内，氯离子溶液的峰面积与其浓度呈良好的线性关系（r=l.0000），加样回收率分别为98.6%、99.5%和99.5%,RSD分别为0.82%、0.21%和0.45%（n=3），3批盐酸平阳霉素中氯离子的含量折算成以盐酸计，平均含量为6.83%。结论：本研究建立的离子色谱法操作简单，线性范围、重复性、回收率好，能适用于测定盐酸平阳霉素中氯离子含量，进而得到平阳霉素与盐酸成盐比例为1:3。