药材中人参皂苷检测方案(液相色谱仪)

人参皂苷的 UHPLC 新方法的开发 应用 液相色谱；超高效液相色谱；自动方法开发系统及方法筛选；人参皂苷 作者 摘要 安蓉邢占磊李浪 肖尧* 安捷伦科技(中国)有限公司 目的：使用带有自动方法开发/色谱柱筛选功能的超高效液相色谱 (UHPLC) 系统对于人参皂苷类成分的适宜分离条件进行快速筛选及探索，并在此基础上优化得到快速高效重现性良好的定性定量分析方法。方法：使用自动方法开发系统对分离条件进行筛选和优化后，得到两种基于不同选择性条件的最终方法，方法1，色谱柱： Agilent Zorbax Bonus RP(3.0x50mm， 1.8pm)， 柱温25℃，流动相为超纯水(A)-乙腈(B)，梯度分析，流速1.0mL/min，检测波长 203 nm；方法2，色谱柱： Agilent Zorbax SB-C18 (3.0x150 mm， 1.8pm)，柱温50°℃，流动相为超纯水(A)-乙腈(B)，梯度分析，流速0.6mL/min，检测波长203 nm。结果：使用上述两个方法对标准品和样品进行了分析，所需分析时间均小于10分钟，重现性良好，保留时间 RSD<0.2%， 峰面积RSD<1.0%，样品中的干扰成分与被测成分均可以得到良好分离。结论：两种方法分析快速切分离度良好，能够充分发挥 UHPLC 的分离能力，适合于含有人参皂苷类成分的药材及制剂的分析。Agilent 的方法筛选软件可以快速、无人照管地选择最佳的色谱柱、色谱条件；使方法开发的步骤更趋系统化，更为合理。 前言 人参皂苷 (Ginsenoside) 是一种固醇类化合物，三萜皂苷。主要存在于人参属药材中。人参皂苷被视为是此类药材中的活性成分，具有增加白细胞数量、提高人体免疫力、促进物质代谢、抗疲劳、抗衰老等作用I1]，使用液相色谱方法分析此类成分是控制人参、三七等药材或含此类活性成分药品的重要手段，但是相关样品中的人参皂苷一般需要很长的分析时间，例如：中国药典的方法需要大概90至120分钟时间[21。UHPLC 技术的出现可以使液相色谱分析时间大为缩短，在不损失分离度的情况下大幅提高分析速度，目前已经广泛应用于中药分析领域。 在分析方法的开发过程中，通过改变色谱柱的种类，柱温等条件可以改变分离选择性，从而对较难分离的化合物进行更好的分析，在人参皂苷的分析中， Re 及 Rg1 是一对比较难分离的成分，通常需要比较长时间(大概20分钟[3])的等度或缓梯度先把这两个化合物分开，但是这会严重影响分析速度，延长分析时间。 在这篇文章中，我们使用了基于 Agilent 公司的 1260或1290超高效液相色谱系统的自动方法开发系统及软件[3]对色谱柱和其他分析条件进行了自动筛选，并从中选出最适合人参皂苷分析的色谱柱及相应分析条件，并在此基础上进行改进和优化，最终得到了两个基于不同选择性特性的高效快速的分析方法，可分别用于不同的分析目的。通过这个研究，我们找到了人参皂苷在不同色谱柱上的色谱行为差异；同时也为类似的方法开发工作推荐一个有用的工具。 仪器试剂及色谱条件 仪器和试剂 Agilent 1290 Infinity 自动方法开发系统，包括：1290色谱泵、自动进样器、两个柱温箱(均配置8位9通阀)组成的柱温箱簇、、二极管阵列检测器； ChemStation色谱工作站及 AgilentChemStation Method Scouting Wizard 软件。方法开发系统及方法筛选软件是仪器根据不同需求增加不同切换阀、柱温箱构成。 利用方法筛选软件对多根色谱柱(最多8根)及多个色谱条件进行排列组合，在无人照管的情况下自动完成分析任务。方法筛选软件能根据谱图中色谱峰数量、分离度及保留时间等方法开发所关注的参数生成报告。 Agilent 1260 Infinity 液相色谱系统，配备脱气机，四元泵，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器。 ( Agilent 1220 Infinity 整体式液相色谱，配备脱气机，二元泵，自动 进样器，柱温箱，二极管阵列检测器。 ) ( 色谱柱：Agilent Zorbax Bonus RP (3.0x50 mm，1.8 pm)，Agilent Zorbax SB-C18 (3.0x150 m m， 1.8pm)。 ) ( 以上设备，耗材及软件均由 Agilent Technologies，Inc. (美国)生 产制造。 ) 实验所用的对照品均购买自中国食品药品检定研究院；乙腈为HPLC 级试剂 (Sigma-Aldrich)，实验用水由 Milli-Q纯水机(Merck-Millipore，德国)制备；所有样品购自本地药店。 实验条件 方法1：色谱柱 Agilent Zorbax Bonus RP (3.0x 50 mm， 1.8 um)，柱温25°℃，流动相：超纯水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱条件见表1，流速：1.0 mL/min， 进样量：3pL，检测波长203 nm。 表1.方法1梯度洗脱时间表 时间 0 1.5 4 4.6 6 B% 22 23 41 22 22 方法2：色谱柱 Agilent Zorbax SB-C18 (3.0x150 mm， 1.8 pm)，柱温：50℃，流动动：超纯水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱条件见表2，流速：0.5mL/min，进样量：3pL，检测波长 203nm，检测波长203 nm。 表2.方法1梯度洗脱时间表 时间 0 7 8 8.1 12 B% 28 50 100 28 28 结果及讨论 重现性：对上述样品进行了重现性考察，重现性良好，保留时间RSD 均小于0.2%， 峰面积RSD 均小于1.0%，结果见图2. 方法1的分析结果 根据上述条件(方法1)对含有三七成分的中药成分进行了分离，五种主要人参皂苷类成分分离良好，并且不受其他干扰组分的影响，具体分析结果见图1： 图1.用方法1对含有三七的成方制剂中人参皂苷的分析 图2.重现性；含有三七的成方制剂中人参皂苷的分析 专属性：进行专属性考察，对空白、标样及样品分别进行了分析，从结果可以看出(图5)，溶剂中的杂质对实际样品的分析没有干扰。 图3.样品、对照品及空白谱图的重叠 图4.样品：三七总皂苷 样品分析和方法的调整：在分析样品时，发现不同样品中所含有的干扰成分会有所差别，从而对被测成分分析产生影响，因此需要根据实际情况对梯度进行细微的调整以保证分离效果，图4至6为分析不同样品的结果。 图5.含有三七的成方制剂A 图6.含有三七的成方制剂B 方法2的分析结果 图7是使用方法2对含有三七的中药制剂进行分析得到的结果，各个被测组分均可以与干扰物质得到良好分离，与方法1相比较，分析时间变为12分钟， 且 Rg1 与 Re 的出峰顺序发生颠倒，但是由于使用线性梯度，使得 Rg1 与 Re 峰型更加尖锐，并且使各个被测组分峰位置分布比较平均，为应对不同样品中的干扰成分时进行的梯度微调留下了更多余地。 方法筛选和优化的思路 根据本实验室原来从药典方法转换的 UHPLC 方法的色谱条件，稍加修改后，选择三种不同的梯度程序，四根不同品牌(分别是：Bonus RP， Zorbax SB-C18，Eclipse Plus C18 及 Extend C18)同样规格的色谱柱，25°℃及30℃两个不同色谱柱温度排列组合。 图8即其中一个结果；在25℃条件下其中一个梯度程序下的四种不同色谱柱的比较结果。 图7.用方法2对含有三七的成方制剂中人参皂苷的分析 从对以上四根色谱柱的筛选结果可以看出， Bonus RP 色谱柱对于极性较大的几个人参皂苷成分，尤其是 Re 和Rg1两个较难分离的化合物有最好的分离选择性，由于分离效果良好，可以在此色谱柱的基础上进行进一步优化，提高起始有机相比例，从而进一步提升分析速度。 同时，在对这个分析法进行优化时发现，温度对人参皂苷 Re 及Rg1分离的影响很大，从方法筛选的结果中可以观察到，温度提高会使这两个峰的分离度下降。所以在方法1中选择了25°C作为最终条件。同时；乙腈比例的提高也引起这两个峰的分离度下降，所以在方法筛选中起始条件的乙腈含量不能超过22%。因此，如果想加快分析速度，只能使用更陡的梯度曲线洗脱保留较强的其他人参皂苷，导致方法后半段的峰容量降低，增加强保留人参皂苷成分之间以及与干扰组分分离的难度。 为了使梯度变化更加缓和，提高方法后半段峰容量，根据方法筛选的结果，选择了一根对 Re 及Rg1 保留最强的 Agilent ZorbaxSB C18色谱柱，尝试将温度提高、同时提高条件起始时的乙腈比例， Re 及Rg1 两个物质的出峰顺序颠倒，并且可以达到良好的分离。 结论 使用方法开发系统及自动方法筛选软件，可以系统地开发新方法。通过对方法筛选结果的分析，找到了更适用于人参皂苷分析的色谱柱： Bonus RP。使用 1.8 pm 颗粒、50mm 长的 Bonus RP 超高效液相色谱柱开发了分析时间仅需6分钟的超高效液相色谱方法。该方法重现性良好，通过对各种有代表性样品的分析，证明这个方法对各种样品都具有很好的分离度，杂质干扰也很小。 同样根据方法筛选的结果，开发了另一种分析人参皂苷的方法。这第二种方法使用法其经典、耐用的 Agilent Zorbax SB-C18 柱，在较高色谱柱温度、更高的起始有机溶剂比例的条件下，用线性梯度在10分钟内也完成了人参皂苷的分析。因使用线性梯度、1.8 pm 颗粒、150mm 长的超高效色谱柱，提供更高的分离能力。 ( 参考文献 ) ( 1 窦德强，靳玲等，人参的化学成分及药理活性的研究进展与展望，沈阳药科大学学报，1999，02 ) ( 2 中 国药典2010版(一部)，20 1 0.8 ) ( 3 马双成等，常用中药标准物质分析析图；人民卫生出版社， 2010.5 ) ( 4 Agilent 1200 Infinity Series Multi - method Solutions，5990-6226EN，Sept. 2010. ) 更多信息 ( 本文仅代表典型的结果。更多有关我们产品和服务，请访问我们 的网站： www.agilent.com/chem/cn。 ) www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司，2014 2014年3月3日，中国印刷 5991-4164CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies 使用基于Agilent 公司的1260 或1290 超高效液相色谱系统的自动方法开发系统及软件对色谱柱和其他分析条件进行了自动筛选，并从中选出最适合人参皂苷分析的色谱柱及相应分析条件，并在此基础上进行改进和优化，最终得到了两个基于不同选择性特性的高效快速的分析方法，可分别用于不同的分析目的。通过这个研究，我们找到了人参皂苷在不同色谱柱上的色谱行为差异；同时也为类似的方法开发工作推荐一个有用的工具。