动物中氯丙那林检测方案(液质联用仪)

thermoscientific 热线800 8105118电话4006505118www.thermofisher.com仅用于研究目的。不可用于诊断目的。 ◎ 2018 Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除非另有指明。 全新一代三重四极杆液质联用仪TSQFortis 针对18种β-受体激动剂的检测方法 汪洋，徐牛生，赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 关键词β-受体激动剂， TSQ Fortis，兽药残留 本文利用赛默飞全新液相色谱串联三重四极杆质谱VanquishHorizon-TSQ Fortis建立了快速检测18种β-受体激动剂类化合物的方法。此18种化合物在0.05-500 ng/mL浓度范围内线性关系良好(r2>0.993)，LOD及LOQ均能满足国标规定的检测要求，运用本方法和设备可实现对动物源性食品中β-受体激动剂类化合物的检出和定量。 1、引言 β-受体激动剂在医学临床上可用于治疗支气管哮喘、阻塞性肺炎等病症，同时也可用于治疗马、牛的晚产和流产。20世纪80年代初期，，-一系列试验研究发现当β-受体激动剂使用剂量是治疗剂量5-10倍时，可以使猪、牛、羊等动物脂肪分解代谢增强，蛋白质合成速度增加，若长期使用含有β-受体激动剂的饲料，可以提高饲料转化率，同时能增加动物体重和肌肉组织含量，以提高瘦肉率，起到营养再分配作用。但是长期使用会对机体产生毒副作用。目前猪、牛、羊等动物通常使用过量的β-受体激动剂类药物以促进生长，致使β-受体激动剂在动物机体内造成蓄积。人类食用含有β-受体激动剂残留的动物性食品后，会对人体健康造成极大危害，严重时可引发急性中毒反应，常见中毒症状表现为肌肉震颤或疼痛，心率过快，头痛眩晕、恶心呕吐等，严重时可导致休克造成死亡。 由于β-受体激动剂所产生生危害，2012年5月1日实施的《饲料和饲料添加剂管理条例》规定禁止将国务院农业行政部门公布的包括β-受体激动剂在内的任何物质添加到饲料中。国家标准《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》(GB/T：22286-2008)适用于猪肝和猪肉中沙丁 胺醇、特布他林林塞曼特罗等11种β-受体激动剂的检测，该方法利用液相色谱-串联质谱技术，采用多反应监测(MRM)模式检测，内标法定量，目标物的检出限为0.5 pg/kg。国家标准《河豚鱼、河鳗和烤鳗中12种β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》(GB/T 22950-2008)适用于河豚鱼、河鳗和烤鳗中溴布特罗、塞曼特罗和克伦特罗等12种β-受体激动剂的确证和定量，利用液相色谱-串联质谱法检测，采用多反应监测(MRM)模式检测，内标法定量；莱克多巴胺、沙丁胺醇、塞曼特罗、克仑潘特罗和克伦特罗的方法检出限为0.1pg/kg，其它化合物的方法检出限为0.5 ug/kg。 2.1仪器与试剂 2.1.1 Thermo Fisher Vanquish Binary Horizon超高效液相色谱仪 2.1.2 Thermo Fisher TSQ Fortis三重四极杆质谱仪 2.1.3甲醇(色谱纯，美国Thermo Fisher公司)；实验用水为Milli-Q去离子水；甲酸(色谱纯， SIGMA) ( 2.1.418种β-受体激动剂类化合物标准品均购自德国Dr.Ehrenstrofer公司 ) 2.2化合物信息及溶液配制 ( 2.2.1本实验涉及的18种β-受体激动剂类化合物的基本信息见表1。 ) 化合物名称 分子式 分子量 CAS号 克伦特罗(Clenbuterol) CHC，N，O 277.19 37148-27-9 马布特罗(Mabuterol) CHCIFN，O 310.74 56341-08-3 齐帕特罗(Zilpaterol) CHNO 261.32 117827-79-9 西马特罗(Cimaterol) CHNO 219.28 54239-37-1 溴布特罗(Brombuterol) CHBr，N，O 366.09 41937-02-4 克仑潘特(Clenpenterol) CHCINO 327.68 37158-47-7 莱克多巴胺(Ractopamine) CHNO. 301.38 97825-25-7 沙丁胺醇(Salbutamol) CHNO 239.31 18559-94-9 特布他林(Terbutaline) CHNO， 225.29 23031-25-6 福莫特罗(Formoterol) iCHNO 344.41 73573-87-2 异克舒令(Isoxsuprine) CHCINO， 337.84 579-56-6 利托君(Ritodrine) CHNO， 287.35 26652-09-5 苯乙醇胺 A(Phenylethanolamine A) CHNO 344.17 1346746-81-3 氯丙那林(Clorprenaline) CHCINO 213.71 3811-25-4 妥布特罗(Tulobuterol) CHIgCINO 227.73： 41570-61-0 班布特罗(Bambuterol) CHNO 367.45 81732-65-2 西布特罗(Cimbuterol) C3HgNO 233.31 54239-39-3 羟甲基克伦特罗(Hydroxy- methylclenbuterol) CHCI，N20， 293.19 38339-18-3 2.2.2储备液：分别精确尔取5mg标准品粉末，溶解于50 mL甲醇中 2.2.3系列标准曲线：以50：50甲醇水作为溶剂，稀释成系列标准曲线 0.02 ng/mL-500 ng/mL 2.3色谱条件： 色谱柱： Thermo Hypersil GOLD aQ(1.9 um， 100x2.1 mm)；柱温：30℃；进样量：5uL； 流动相：A为0.1%甲酸水，B为0.1%甲酸甲醇，梯度洗脱程序见表2。 表2梯度洗脱程序 时间 A% B% 流速mL/min 0.0 100 0 0.3 6.0 70 30 0.3 9.0 60 40 0.3 11.0 10 90 0.3 12.0 100 0 0.3 16.0 100 0 0.3 可加热电喷雾电离源(HESI)，正离子扫描模式；扫描方式： SRM；喷雾电压 (+)：3500V；离子传输管温度：300℃；鞘气压力38 arb；辅助气压力 4 arb；离子源温度：450℃；碰撞气压力：1.5mTorr；选择反应监测离子对信息见表3。 表318种β-受体激动剂类化合物质谱采集参数 CollisionTube Source Compound Precur- Product Frag- Energysor (m/z) (m/z) Lens(V) menta-tion 195.97*111.95 154.05417.13 氯丙那林 214.125 88 9.8 西马特罗 220.162 202.042* 9.68 160.19616.67 -90 8.2 特布他林 226.062 152.095*16.04 125.07124 101 13.1 妥布特罗 228.112 154.125*16.25 118.42928.8 88 9.8 西布特罗 234.162 160.125*14.6 143.07125.09 92 9.8 沙丁胺醇 240.175 148.125* 18.14 222.12510.48 93 9.8 齐帕特罗 262.175 244.196* 12.58 185.042 23.87 111 11.4 克伦特罗 277.088 202.946*16.04 258.75 10.6 96 9.8 利托君 288.175 270.149* 12.75 104 9.8 121.071 22.35 克伦潘特罗 291.088 202.958*15.74 273.09510.64 97 9.8 羟甲基克伦 特罗 293.088 275.083*11.49 202.958 17.81 101 9.8 异克舒令 302.175 284.196*13.93 107 28.42 100 9.8 莱克多巴胺 302.175 164.167*15.57 103 9.8 284.202 11.61 马布特罗 311.138 237.048* 17.01 101 9.8 293.04211.28 福莫特罗 345.175 149.125*19.03 103 11.4 327.12513.38 苯乙醇胺A 345.225 327.036*12.29 102 8.2 150.12522.23 溴布特罗 367 292.875*18.23 105 8.2 348.95811.87 班布特罗 368.212 294.042* 18.82 72.125 31.66 110 11.4 72.125 31.66 注：带*的为定量子离子 3.1灵敏度测试 采用上述仪器分析方法，18种β-受体激动剂类化合物在16分钟内均可获得良好的色谱峰，图1为18种β-激动剂类化合物在LOQ(0.05-0.1 ng/mL)浓度的提取离子流图。 3.2线性范围测试 采用上述仪器分析方法，对18种β-受体激动剂类化合物进行线性范围测试，线性相关系数r2均大于0.993，线性关系良好。18种β-受体激动剂类化合物LOD (S/N>3)、LOQ(S/N≥10)、线性范围及线性相关系数见表4，化合物标准曲线图见图2。 表418种β-受体激动剂类化合物的LOD、LOQ、线性范围及线性相关系数 LOD LOQ Linearity Compound range (ng/mL) Linearity(r2) (ng/mL) (ng/mL) 氯丙那林 0.02 0.05 0.05-100 0.9961 西马特罗 0.02 0.05 0.05-100 0.9970 特布他林 0.02 0.05 0.05-100 0.9958 妥布特罗 0.02 0.05 0.05-200 0.9977 西布特罗 0.02 0.05 0.05-500 0.9973 沙丁胺醇 0.02 0.05 0.05-100 0.9946 齐帕特罗 0.05 0.1 0.1-200 0.9965 克伦特罗 0.02 0.05 0.05-200 0.9980 利托君 0.02 0.05 0.05-100 0.9978 克伦潘特罗 0.02 0.05 0.05-200 0.9972 羟甲基克伦 特罗 0.02 0.05 0.05-200 0.9972 异克舒令 0.02 0.05 0.05-100 0.9993 莱克多巴胺 0.02 0.05 0.05-100 0.9961 马布特罗 0.02 0.05 0.05-200 0.9964 福莫特罗 0.02 0.05 0.05-200 0.9977 苯乙醇胺A 0.02 0.05 0.05-500 0.9972 溴布特罗 0.02 0.05 0.05-200 0.9962 班布特罗 0.02 0.05 0.05-200 0.9934 图2β-受体激动剂类典型化合物标准曲线图 3.3稳定性测试 采用上述仪器分析方法，对18种β-受体激动剂类化合物进行稳定性测试，考察浓度0.5 ng/mL， 进样量5 pL 连续进样6针，实验结果见表5。18种β-受体激动剂类化合物相对标准偏差(RSD)均小于6%，5实验结果证明仪器具有良好的稳定性。 表518种β-受体激动剂类化合物连续6针的峰面积及RSD值(C=0.5 ppb， N=6) 0.5 ppb-1 0.5 ppb-2 0.5 ppb-3 0.5 ppb-4 0.5 ppb-5 0.5 ppb-6 RSD% 氯丙那林 6045 6119 6409 6280 6078 6056 2.39 西马特罗 14466 14751 14935 15162 15157 15323 2.11 特布他林 9000 8904 9283 9886 9489 9601 3.98 妥布特罗 8483 8608 8955 8601 8600 8438 2.11 西布特罗 7226 7662 7600 7102 7304 7484 2.99 沙丁胺醇 8956 9135 9155 8753 8644 9941 5.06 齐帕特罗 4724 4596 4785 4758 4813 5022 2.91 克伦特罗 5500 5416 5555 5563 5399 5638 1.67 利托君 6597 6669 6615 6651 6761 6901 1.71 克伦潘特罗 6801 7180 6489 6715 6315 6791 4.42 羟甲基克伦特罗 4622 4697 4853 4637 4597 4866 2.52 异克舒令 20387 20011 19977 20749 20429 20234 1.42 莱克多巴胺 4099 4254 4187 4407 3931 4402 4.35 马布特罗 8094 8402 8200 8370 7993 8563 2.57 福莫特罗 5158 5776 5481 5321 5798 5379 4.67 苯乙醇胺A 13505 12944 13100 13036 12776 12996 1.87 溴布特罗 3118 2922 3135 3065 3107 3277 3.69 班布特罗 8479 8428 8344 8157 7974 7837 3.16 本文利用ThermoFisher新一代三重四极杆液质联用仪TSQ Fortis 建立了同时分析18种β-受体激动剂类化合物的检测方法。实验结果可以看出，基于ThermoFisher TSQ Fortis建立的检测方法不仅具有优异的灵敏度和线性范围，同时具备优异的重现性。本方法可用于18种β-受体激动剂类化合物的日常分析检测。 β-受体激动剂在医学临床上可用于治疗支气管哮喘、阻塞性肺炎等病症，同时也可用于治疗马、牛的晚产和流产。20世纪80年代初期，一系列试验研究发现当β-受体激动剂使用剂量是治疗剂量5-10倍时，可以使猪、牛、羊等动物脂肪分解代谢增强，蛋白质合成速度增加，若长期使用含有β-受体激动剂的饲料，可以提高饲料转化率，同时能增加动物体重和肌肉组织含量，以提高瘦肉率，起到营养再分配作用。但是长期使用会对机体产生毒副作用。目前猪、牛、羊等动物通常使用过量的β-受体激动剂类药物以促进生长，致使β-受体激动剂在动物机体内造成蓄积。人类食用含有β-受体激动剂残留的动物性食品后，会对人体健康造成极大危害，严重时可引发急性中毒反应，常见中毒症状表现为肌肉震颤或疼痛，心率过快，头痛眩晕、恶心呕吐等，严重时可导致休克造成死亡。由于β-受体激动剂所产生的危害，2012年5月1日实施的《饲料和饲料添加剂管理条例》规定禁止将国务院农业行政部门公布的包括β-受体激动剂在内的任何物质添加到饲料中。国家标准《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》（GB/T 22286-2008）适用于猪肝和猪肉中沙丁胺醇、特布他林和塞曼特罗等11种β-受体激动剂的检测，该方法利用液相色谱-串联质谱技术，采用多反应监测（MRM）模式检测，内标法定量，目标物的检出限为0.5 g/kg。国家标准《河豚鱼、河鳗和烤鳗中12种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱-串联质谱法》（GB/T 22950-2008）适用于河豚鱼、河鳗和烤鳗中溴布特罗、塞曼特罗和克伦特罗等12种β-受体激动剂的确证和定量，利用液相色谱-串联质谱法检测，采用多反应监测（MRM）模式检测，内标法定量；莱克多巴胺、沙丁胺醇、塞曼特罗、克仑潘特罗和克伦特罗的方法检出限为0.1 g/kg，其它化合物的方法检出限为0.5 g/kg。