茶叶中草酸检测方案(快速溶剂萃取)

第21卷，第1期2012年1月化学分析计量CHEMICAL ANALYSIS AND METERAGEVo1.21，No.1Jan. 201243 化学分析计量2012年，第21卷，第1期44 快速溶剂萃取-离子色谱法测定茶叶中的有机酸 章剑扬，刘新，车金水，汪琼，陈艳，叶明立 (1.中国农业科学院茶叶研究所，杭州 310008； 2.赛默飞世尔有限公司上海实验室，上海 201203：3.浙江省环境保护科学设计研究院，杭州 310007) 摘要 建立了快速溶剂萃取-离子色谱法(ASE-IC)测定茶叶中的9种有机酸。优化了 ASE 萃取条件，以水为萃取溶剂，80℃下萃取5 min，循环两次。采用 Ionpac AS11 HC 柱分离， KOH溶液梯度洗脱，流速 1.0 mL/min，抑制电导检测。9种有机酸的检出限为 0.009~0.160 ug mL，线性范围为0.5~10 ug mL，相关系数大于 0.999，加标回收率为93.4%~99.2%，相对标准偏差为1.4%~4.1%。 关键词 快速溶剂萃取；离子色谱；有机酸；茶叶 中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：1008-6145(2012)01-0043-03 Determination of Organic Acid in Tea by Accelerated Solvent Extraction-Ion Chromatography Zhang Jianyang， Liu Xin， Che Jinshui， Wang Qiong， Chen Yan， Ye Mingli (1.Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou310008，China； 2.Shanghai Lab， Thermofisher Scientific，Shanghaii2201203， China； 3.Environmental Science Research and Design Institute of Zhejiang Province， Hangzhou 310007， China) Abstract A method was developed for the determination of nine organic acids (OA) in tea by accelerated solventextraction-ion chromatography (ASE-IC). The ASE extraction conditions were optimized. The tea samples were extractedat 80℃， for5 min and two extraction cycles using water as extractant. The Dionex Ionpac AS11 HC was employed as analyticalcolumn， KOH solution as the gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min， and a suppressed conductive detector as thedetector. The method obtained good linearity in the range of 0.5-10 ug/mL for organic acids with relative coefficientmore than 0.999. The detection limits were 0.009-0.160 ug/mL (S/N=3)， the recoveries of the standard additionexperiment ranged from 93.4%-99.2%， and the relative standard deviation ranged from 1.4% to 4.1%. Keywords accelerated solvent extraction； ion chromatography； organic acid； tea 化反应中常为糖类分解的中间产物1-3]。此外，某些有机酸对茶多酚激活-淀粉酶、胰蛋白酶酶活性具有协同效应。因此对茶叶中有机酸的定性、定量分析在茶叶生产管理过程中必不可少11-31，而且对茶叶品质开发具有重要意义。 目前对茶叶中有机酸的提取主要采用浸泡法、回流法和超声提取法。但这些方法的萃取效率较低，且样品之间的误差较大。加速溶剂萃取技术(Accelerated Solvent Extraction， ASE) 是在较高的温度和压力下用溶剂萃取固体或半固体样品前处理方法。在高温高压条件下，待测物从基体上的解吸和溶解动力学过程加快，可大大缩短提取时间，减少溶剂的用量，同时提高对目标产物的提取率4。目前，有机酸常用比色法、分光光度法、HPLC-UV/RI等方法分析，但这些方法存在一定的缺陷，分光光度法需要预分离，衍生化等繁琐处理，而且灵敏度较 茶叶中有机酸的种类较多，有机酸是茶叶香气和滋味的主要成分之一，并且参与茶树的新陈代谢，在生低； HPLC-UV/RI对含碳的有机酸专属性和灵敏度不够[5.6]。采用离子色谱在抑制电导模式下分离检测有机酸，可以得到较低的检出限及很好的重现性，而且步骤简单。 笔者优化了快速溶剂萃取和离子色谱条件，采用快速溶剂萃取(ASE)-离子色谱(IC)法测定茶叶中9种常见的有机酸，得到了满意的结果。 1实验部分1主要仪器与试剂 快速溶剂萃取仪： Dionex ASE350 型，美国戴安公司； 离子色谱仪： Dionex ICS-5000 型，配电导检测器，Chromeleon6.8色谱工作站，Dionex EG 淋先液 ( 联系人：车金水；E-mail：chejinshui@hotmail.com ) ( 收稿日期：2011-12-02 ) 发生器，美国戴安公司； 抑制器：ASRS 300 (4mm)，美国戴安公司；尼龙滤膜过滤头：0.22 um； 甲酸、乙酸、乳酸、丙酮酸、戊酸、己酸、草酸、苹果酸和柠檬酸标准品：阿拉丁试剂有限公司； 氯离子、硝酸根离子、硫酸根离子和磷酸根离子溶液：上海市测量技术研究院； 实验用水为18.2MQ · cm 的二次去离子水。 1.2 ASE 萃取条件 将茶叶粉碎至550 um(30目)左右，过筛。精密称取0.5g粉碎后的样品，与石英砂混匀，倒入垫有玻璃纤维素膜的不锈钢萃取池中，在设定的萃取条件下(表1)用水进行ASE 萃取。将萃取液定容至25 mL，然后过 0.22 um 滤膜过滤头，待离子色谱分析。 表1 ASE 萃取条件 项目 数值 静态萃取时间/ min 5 循环次数 2 吹扫时间/s 90 预热时间/ min 5 吹扫体积/% 60 压力/MPa 10.34(1500 Psi) 1.3 色谱条件 色谱柱： Dionex IonPac AS11 HC (50 mm×4 mm)保护柱，Dionex IonPac AS11 HC (50mm×4 mm)分析柱；淋洗液为发生器产生的高纯 KOH溶液，流速为1 mL/min，梯度淋洗：0~15 min， 浓度为 0.8 mmol/L；15~30 min，浓度为0.8~12 mmol/L ；30~45 min，浓度为12~38 mmol/L ； 45~50 min，浓度为 38~50 mmol/L；ASRS-300 抑制器，电化学自再生抑制模式；进样量：25 uL；电导检测器检测。 2 结果与讨论 2.1 色谱条件的选择 IonPac AS11 HC 色谱柱在测定实际样品中的有机酸方面具有较大的优势，在KOH溶液梯度淋洗条件下，能够同时分离几十种常见的无机阴离子和有机酸。针对茶叶样品中存在的有机酸种类，优化了 KOH 溶液淋洗条件，低浓度 KOH溶液能使F、乳酸和乙酸得到较好的分离。考察了不同的梯度条件对戊酸、己酸、苹果酸、草酸等分离的影响，选择了最优的色谱条件。在此条件下茶叶中常见的有机酸得到了很好的分离， F，CI，NO， SO和PO均对9种有机酸无干扰。图1、图2分别为加入F，CI等干扰后有机酸标准样品和茶叶样品的离子色 1一F；2一乳酸；3一乙酸；4一甲酸；5一丙酮酸；6一戊酸；7一CI；8一己酸；9—NO；10苹果酸；11SO。； 12一草酸；13PO，；14一柠檬酸 图1 9种有机酸标准样品离子色谱图 图2茶叶样品离子色谱图 2.2 ASE 条件选择 2.2.1 萃取溶剂 有机酸极性较强，据文献报道常采用极性较强的溶剂(如水、甲醇、乙醇等)进行提取。实验分别采用水、甲醇、乙醇作为萃取剂，对茶叶中的有机酸进行萃取。结果表明，采用水作为提取液时，对各种有机酸的萃取效果较好，且有机酸色谱峰峰形良好，无杂质干扰。 2.2.2 萃取温度 温度是影响萃取效率的最重要的参数之一。实验考察了4种不同温度(60，80，100，120℃)对9种有机酸提取率的影响。结果表明，80℃时，9种有机酸的提取效果最佳，加标回收率为 93.4%~99.2%。 2.2.3 静态萃取时间和循环次数 以5 min 为静态萃取时间，考察循环次数对9种有机酸萃取率的影响，对同一样品进行3次单循环萃取。结果表明，2次萃取循环能够完全萃取茶叶中的有机酸，5 min 静态萃取时间较为合适。 2.3 工作曲线和检出限 将1000 ug/ mL 有机酸混合标准溶液逐级稀释，配制成0.50，1.0，2.0，5.0，10.0 ug/ mL的系列有机酸混合标准工作溶液，在1.3色谱条件下进行测定。以峰面积Y对有机酸质量浓度X (ug mL) 进行线性回归。9种有机酸的线性关系良好，?均大于0.999。在1.3条件下，以信噪比等于3计算检出限，9种有机酸的检出限范围为 0.009~0.160 ug/mL，线性回归方程及检出限见表2。 表2 工作曲线方程及检出限 有机酸 线性范围/ 检出限/ g'mL 线性方程 ugmL -1 乳酸 0.5~10 Y=0.0510X+0.0129 0.9998 0.025 乙酸 0.5~10 Y=0.093 X+0.0128 0.9996 0.015 甲酸 0.5~10 Y=0.151X+0.0085 0.9998 0.009 丙酮酸 0.5~10 Y=0.015X-0.0016 0.9999 0.100 戊酸 0.5~10 Y=0.041X+0.0020 0.9998 0.090 己酸 0.5~10 Y=0.035X+0.0019 0.9999 0.080 苹果酸 0.5~10 Y=0.067X+0.0056 0.9995 0.100 草酸 0.5~10 Y=0.069X+0.0588 0.9995 0.160 柠檬酸 0.5~10 Y=0.0679 X+0.0060 0.9994 0.120 2.4回收率和精密度试验 称取0.5 g茶叶样品3份，加入混合标样，以ASE 提取，进行离子色谱分析，结果见表3.9种有机酸的加标回收率为93.4%~99.2%，相对标准偏差为1.4%~4.1%。由此可见，该方法的精密度和准确度较高。 表3 加标回收率及精密度试验结果 有机酸 本底值/ 加标量/ 测得量/ 回收率/ RSD/ mg'g mg'g mg'g % % 乳酸 1.650 2.0 3.612 98.1 2.4 乙酸 0.210 0.5 0.699 97.8 1.6 甲酸 0.238 0.5 0.734 99.2 1.4 丙酮酸 ND 0.5 0.467 93.4 3.2 戊酸 ND 0.5 0.478 95.6 2.1 己酸 ND 0.5 0.487 97.4 1.8 苹果酸 2.483 2.0 4.377 94.7 4.1 草酸 4.892 5.0 9.682 95.8 3.1 柠檬酸 3.447 5.0 8.287 96.8 1.7 2.3 ASE 提取与回流提取、超声波提取的比较 回流提取和超声波提取为提取有机酸的传统方法，实验对 ASE 提取、回流提取和超声波提取进行了比较。回流提取：称取0.5g样品，加入100 mL水，于沸水浴中回流提取2h，过滤，定容，过0.45 um过滤膜，待IC分析。超声提取：称取0.5g样品，加入50 mL 水中，于超声波清洗仪上超声提取1h，过滤，定容，过 0.45 um过滤膜，待 我国与俄罗斯合作突破大功率激光器关键技术 不久前，受科技部委托，吉林省科技厅组织召开了大功率激光器技术研究国际科技合作项目验收会，邀请了北京、黑龙江、山东等省专家组成专家组，对项目进行了验收。专家组认为，该项目通过与俄罗斯知名院所合作创新，突破了千瓦级大功率激光器多项关键技术；在国内首次开发出连续 IC分析。实验结果表明，回流提取和超声提取对各种有机酸的提取效率接近，但平行样品之间测定结果的相对标准偏差(3.7%~8.2%)波动较大； ASE对有机酸的提取率高于回流提取及超声提取 10%左右，且稳定性更好，测定结果的相对标准偏差为1.4%~4.1%。 2.4+样品测定 选取5种不同茶叶的样品，按1.2萃取条件进行萃取，在1.3色谱条件进行测定，实验结果列于表4。 表4茶叶样品中9种有机酸测定结果 mg/g 有机酸 绿茶1 绿茶2 红茶 白茶 普洱茶 乳酸 1.650 1.628 0.614 0.874 1.887 乙酸 0.210 0.120 0.162 0.148 0.241 甲酸 0.238 0.269 0.333 0.233 0.305 丙酮酸 ND ND N.D ND ND 戊酸 ND ND 0.027 ND 0.039 己酸 ND ND 0.052 ND 0.047 苹果酸 2.483 2.390 2.174 2.742 3.680 草酸 4.892 5.668 4.924 4.682 5.794 柠檬酸 3.447 3.058 3.255 4.032 4.125 3结语 采用 ASE 对茶叶中的9种有机酸进行提取，然后采用 IC 进行分离分析，用电导检测法检测，该方法操作简单、快速，重现性好、回收率高，可用于茶叶样品中有机酸的快速测定，并且具有较高的实用价值。 ( 参考文献 ) ( [1] 谭和平，叶善蓉，陈丽，等.茶叶中有机酸的测试方法概述[J]. 中国测试技术，2008，34(6)：77-80. ) ( [2] 丁玲，屠幼英，陈晓敏.高效液相色谱测定紧压茶中有机酸条件 研究[J].茶叶，2005，31(4)：224-227. ) ( [3] 张光军，许建文，丁明玉.离子交换色谱法同时分析绿茶中有机酸和无机阴离子的含量[J].新乡医学院学报，2002，19(1)： 36-38. ) ( [4] 刘 刘静.戴安公司 ASE 快速溶剂萃取技术-解决您化学实验样品前处理的最新技术[J].检验检疫科学，2003，13(2)：58. ) ( [5] 吴飞燕，贾之慎，朱岩.离子色谱电导法测定酒中的有机酸和无机阴离子[J].浙 江 大学学报，2006，33(3)：312-315. ) ( [6] 傅彤，刘庆生，范志影，等.应用离子色谱测定青贮饲料中有机酸含量的研究[J].中国畜牧兽医，2005，21(5)：16-17. ) 输出千瓦级高效节能半导体激光加工机光源；实现了百瓦级质量激光输出。该项成果已在工业、医疗等重要领域获得了应用，取得了显著经济社会效益，并获国家科技进步二等奖。通过项目的实施，研究小组与俄罗斯合作方建立了长期稳定的合作机制，形成了良好的国际科技合作与交流环境，拓宽了合作渠道。 (科技日报) ◎ China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net 茶叶中有机酸的种类较多，有机酸是茶叶香气和滋味的主要成分之一，并且参与茶树的新陈代谢，在生化反应中常为糖类分解的中间产物［1–3］。此外，某些有机酸对茶多酚激活 – 淀粉酶、胰蛋白酶酶活性具有协同效应。因此对茶叶中有机酸的定性、定量分析在茶叶生产管理过程中必不可少［1–3］，而且对茶叶品质开发具有重要意义。采用 ASE 对茶叶中的 9 种有机酸进行提取，然后采用 IC 进行分离分析，用电导检测法检测，该方法操作简单、快速，重现性好、回收率高，可用于茶叶样品中有机酸的快速测定，并且具有较高的实用价值。