动物源性食品中红霉素检测方案(固相萃取仪)

Raykol Applications Collection-RKFT-F003 全自动固相萃取-高效液相色谱法串联质谱测定动物源性9种大环内脂类抗生素药物 大环内酯类(Macrolides)是由链霉菌产生的-类弱碱性抗生素、因分子中含有一个内酯结构的十四员或十六员大环而得名。属十四员大环的抗生素有红霉素、罗红霉素和竹桃霉素。属十六员大环的有吉他霉素、替米考星、泰乐霉素、螺旋霉素和交沙霉素等。大环内脂类药物对于动物呼吸道疾病有很好的治疗效果。然而过多地使用大环内脂类药物会对人体消化道产生极强的副作用，使人恶心，干呕，腹胀腹泻等，严重可致人不可逆的耳聋。 欧洲国家对于大环内脂类的检测比较早，主要集中在蜂蜜，蘑菇，粮食等存在真菌的产品中，采 用方法为有机溶剂提取，然后进行固相萃取净化。检测手段有气质，液质等方法，但是对于高效液相色谱的方法开发较少，这主要是因为大环内脂类对紫外-可见光的吸收较弱，导致此法不具有较高的灵敏度。对于动物源性的肉类样品的检测较少，因为个别大环内脂类药物的稳定性差，在动物体内的代谢快，，非常容易被动物排出体外。 本方法参考GB/T 20762-2006方法中对于大环内脂的检测，采用乙腈对目标化合物的提取，以HLB柱对复杂肉质样品净化，最终采用液质联用实现对大环内脂的检测。 图-1.9种大环内脂抗生素结构图 关键字：全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；大环内脂类抗生素 2.仪器和耗材 Raykol Fotector Plus 全自动固相萃取仪 高效液相色谱 (HPLC) Agilent 1260，质谱普测器(MS) Agilent 6410 氮气吹干装置： Raykol AutoEVA-60全自动平行浓缩仪 HLB固相萃取柱(CNW， 500 mg/6 mL)甲醇(优级纯)，水 3.样品制备与净化 NazEDTA (0.1 mol/L) -MCIlvaine (0.1M)缓冲溶液(pH4.0)， 准确称取 60.2 g乙二胺四乙酸二钠，磷酸氢二钠17.8 g和柠檬酸21.0 g于烧杯中，加入1000 mL的纯净水，加入浓盐酸调节 pH值至4.0。如果该缓冲液在放置过程中易析出晶体，那么请将浓度减半进行配制，以免后续样品提取液中析出晶体堵塞管路。 3.1提取 准确称取搅碎后的动物源性样品5.0g于50mL离心瓶中，加入2.0g无水硫酸钠，加入20 mL乙腈进行提取，均质 1.0 min， 3800转离心 5.0 min，重复一次。取上清液于 100 mL液液漏斗中，加入30mL正己烷，振摇20次，静置取下层乙腈溶液。重复上述提取操作一次。将所得乙腈溶液于全自动浓缩仪上浓缩至近干(40℃， 5 psi)， 加入10mLNazEDTA (0.1 mol/L) -MCIlvaine (0.1M)缓冲溶液，摇匀备用。 3.2净化 分别以5mL甲醇和5mL水活化 HLB 柱(Oasis 500 mg， 6 mL)后，将上述的样品液以2mL/min 的速度进行上样，并用3mL 的水溶液清洗样品瓶。以10 mL 的水溶液对固相萃取柱进行淋洗 除去残留的无机盐；以20-30%的甲醇溶液对固相萃取柱上的基质进行淋洗(林可霉素和替米考星采用20%的甲醇水溶液淋洗，其余大环内脂均采用30%的甲醇水溶液淋洗)。在20 psi 的氮气流下吹干HLB柱，最后以10 mL 的甲醇洗脱目标化合物(具体的净化步骤请见图-2)。将所得洗脱液在浓缩仪上进行吹干，氮气压力为5 psi， 温度为40℃，浓缩至近干，加入50%乙腈水溶液定容至1mL，上机测试。 3.3固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科Fotector Plus/ Auto SPE 固相萃取柱 HLB (Waters， Oasis， 500 mg/6 mL) 活化 甲醇 淋洗 水溶液，20%-30%甲醇水溶液 洗脱 甲醇溶液 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 体积(mL) 时间[min) 1 清洗样品通道 CH30H 40 5 1.7 2 活化 CH30H 废液1 10 5 0.9 3 活化 H20 废液1 10 5 0.9 4 上样 废液1 2 10 5.8 5 清洗样品瓶 H20 废液1 100 3 2.3 6 淋洗 H20 废液1 20 10 1.1 7 淋洗 30%甲醇水溶液 废液1 10 5 0.9 8 气推 废液1 40 10 1.1 9 吹干 15 10 清洗注射泵 CH30H 10 5 0.9 11 洗脱 CH30H 收集 2 10 5.6 12 气推 收集 10 5 1.1 13 结束 14 图-2.Fotector Plus 动物源性大环内脂固相萃取方法 4.检测条件 4.1 色谱柱条件 离子模式 ESI 吹扫气 11 L/min 氮气温度 350°C 簇电压 4000 雾化压力 35 psi 梯度洗脱 大环内脂：0.0-1.5 min，93%的流动相A； 1.5-3.0 min， 60%的流动相A； 3.0-3.5 min， 10%的流动相 A， 保持2 min； 5.50-6.0 min， 93%的流动相A； 6.00-10.0 min， 93%的流动相 A。 4.2 MRM 参数 表-1.9种大环内脂的串联质谱检测参数 Compound Name Precursor Ion Product Ion Dwell Fragmentor Collision Cell Accelerator Voltage Energy 407 359.1 20 128 13 7 林可霉素 126 20 128 29 7 174.1 20 215 37 7 克林霉素 425 377.2 20 150 17 7 126.2 20 150 29 7 替米考星 869 696.5 20 215 41 7 174.3 20 215 49 7 红霉素 734 576.4 20 160 13 7 158.1 20 160 29 7 泰乐霉素 916 145.1 20 215 41 7 174.1 20 215 37 7 215.2 20 215 22 7 吉他霉素 772 174.2 20 215 29 7 109.1 20 215 41 7 罗红霉素 837 158.4 20 160 40 7 158.4 20 160 40 7 交沙霉素 828 174.1 20 215 33 7 109.1 20 215 49 7 螺旋霉素 843 174.2 20 185 25 7 109.1 20 185 41 7 4.3 MRM色谱图 下图为9种大环内脂类化合物的标准溶液(50ppb)在液相色谱质谱联用仪上的质谱图： +ESI MRM Frag=128.0V CF=0.000 DF=0.000 CID@29.0(407.0000->126.0000) BY. d 林可霉素 x10/3.53.2532.752.52.2521.751.51.2510.750.50.250-0.25 +ESI MRM Frag=150.0V CF=0.000 DF=0.000 CID@29.0 (425.0000->126.2000) BY.d 克林霉素 +ESI MRM Frag=160. 0V CF=0. 000 DF=0.000 CID@29.0(734.0000->158.1000)BY. d 红霉素 0.20.40.60.811.21.41c8mh?深集时尚3.23.43.63.844.24.4 +ESI MRM Frag=160.0V CF=0.000 DF=0.000 CID@40.0 (837.0000->158.4000) BY. d +ESI MRM Frag=215.0V CF=0. 000 DF=0.000 CID@49.0(828.0000->109.1000) BY. d 交沙霉素 0.20.40.60.811.21.41c8mts深集时尚i3.23.43.63.844.24.4 5.样品测试 5.1 基质效应验证 质的工作曲线进行定量。 取空白样品，按照上述的样品前处理步骤，净化浓缩至近干后，加入标准使用液(1ppm，100 pL)，定容成 1mL， 供LC/MS-MS 检测，工作曲线计算。如果基质加标浓度准确，则可以直接用纯溶剂标准曲线对样品进行定量；如果不准确，请使用含有基 选择定量离子的峰面积作为纵坐标，浓度作为横坐标，做相关曲线，曲线为线性回归，各点权重相等，拟合出工作曲线，要求 R>0.99；此曲线两周需要重新配置一次。 5.2样品基质加标测试 取猪肉样品(5.0g)，加入上述9种大环内脂类标准品(100 uL， 1000 ppb)， 进行加标回收验证(n=3)。测试结果如表-2所示，9种大环内脂的回 收率在77.66-113.38%之间，只有林可霉素的回收率在77.66%。9种大环内脂的相对标准偏差均控制在7.5%以内。说明该方法能够很好地运用于肉质样品中9种大环内脂的检测。 表-2.猪肉样品的加标回收率及 RSD 值(20ng/kg) 化合物 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 平均回收率 样品-1 样品-2 样品-3 Average RSD(%) (Compound) Sample-1 Sample-2 Sample-3 Recoveries (%) 林可霉素 74.33 77.96 80.71 77.66 4.12 替米考星 90.09 94.17 93.17 92.48 2.30 克林霉素 115.39 113.06 111.71 113.38 1.64 红霉素 88.83 88.58 91.37 89.59 1.72 泰乐霉素 86.40 82.98 96.29 88.56 7.81 吉他霉素 88.78 94.03 99.90 94.24 5.90 罗红霉素 90.13 79.34 82.28 83.92 6.65 交沙霉素 94.66 89.77 81.86 95.43 7.28 螺旋霉素 108.98 110.40 113.71 111.03 2.18 6.结果与讨论 6.1大环内脂类化合物对于酸碱性较敏感，固相萃取净化过程中需要进行 pH调控，控制待净化的样品液pH值在4.3-4.9之间为宜。 7.仪器特征优势 本方法可实现样品提取和净化全程自动化，提取过程只需将样品及溶剂放置离心管，通过AH-30全自动均质器连续进行自动均质提取，其刀头特殊性使得样品能够完全均质提取，解放实验室人员长期待在实验室手动均质提取的束缚；提取液通过Fotector Plus 全自动固相萃取仪进行净化，解决操作人员手动带来的误差以及样品量多的问题，同时全自动化固相萃取仪的高效性提高实验室工作效 6.2样品洗脱液在氮吹步骤时应以吹至近干为宜，不可过于干燥，否则会导致回收率损失。 率；净化完的洗脱液可直接转移至 Auto EVA-60 全自动平行浓缩仪进行平行浓缩，相对于手动氮吹浓缩仪来说，全自动平行浓缩仪避免样品多次转移过程，减少样品转移造成的损失，同时可设置相应时间，浓缩到相应的体积，避免实验室人员担心样品出现吹干的问题，必须提出的是，样品成批性处理，对于手动氮吹仪来说是无法比拟的。 全自动均质器样品提取 全自动固相萃取仪样品净化 全自动浓缩仪样品浓缩 邮箱： info@raykol.com热线：址：： www.raykol.com 邮箱： info@raykol.com热线：址：：www.raykol.com 本方法参考GB/T 20762-2006方法中对于大环内脂的检测，采用乙腈对目标化合物的提取，以HLB柱对复杂肉质样品净化，最终采用液质联用实现对大环内脂的检测。