蔬菜水果中炔苯酰草胺残留检测方案(固相萃取仪)

Raykol Applications Collection-RKFT-F011 全自动固相萃取-气相色谱/质谱联用测定蔬菜水果中多种农药以及相关化学品残留 本应用文章参考 GB 23200.8-2016《食品安全国家标准粮谷中475种农药及相关化学品残留量测定气相色谱-质谱法》，采用C18及GCB/NH，柱进行净化气相色谱/质谱联用技术检测，建立了复杂蔬菜水果样品基质中对多种农残方案高灵敏度的前处理和检测分析方法。蔬菜水果样品使用乙腈进行 关键字：全自动固相萃取； GC-MS；农残 2.仪器、试剂以及耗材 Raykol Fotector Plus 全自动固相萃取仪 C18固相萃取柱(1000 mg/6mL CNWBOND) GCB/NH2固相萃取柱(500mg/500mg， 6mLCNWBOND) 气相色谱/质谱联用仪 Agilent 7890A+5975C 3.样品提取与前处理 3.1样品提取 称取20g试样(精确至0.01g)于80mL离心管中，加入40 mL乙腈，用均质器在15000 r/min匀浆提取1 min， 加入5g氯化钠，再匀浆提取1 min，将离心管放入离心机，在3000 r/min 离心5 min，取上清液20 mL(相当于10g试样量)，待净化。 3.2 第一次净化 将 C18 柱安装在 Fotector Plus 上，活化：约10mL乙腈，上样：将待净化的乙腈提取液转移到固相萃取柱上，淋洗：：15 mL乙腈淋洗收集所有流出液，具体步骤见图-1所示。采用 AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪将上述收集液液吹吹缩至1mL 左右。 3.3第二次净化 将 GCB/NH柱接在固相萃取装置上，加入约2g无水硫酸钠于柱上方，下接收集管。 均质提取，经盐析、离心后，取上清液，经石墨化碳黑与氨基柱串接固相萃取净化，用甲苯+乙腈(1+3)洗脱农药以及相关化学品，洗脱后经过溶剂交换，供GC/MS检测，以环氧七氯为内标，采用内标法定量。 氮气吹干装置： Raykol AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪 Raykol Auto Prep 200全自动液体样品处理工作站 气相色谱柱： DB-1701 30 mx0.25mmx0.25um 活化：约4mL乙腈+甲苯(3+1)；；上样：将浓缩液转移至固相萃取柱上方，以6mL乙腈+甲苯(3+1)分三次清洗鸡心瓶后转移到固相萃取柱上洗涤串联柱：25mL乙腈+甲苯(3+1)。 40°℃水浴温度下，将收集液旋转浓缩至 0.5mL，详细过程请见下图-2。根据样品基质的复杂程度，如果样品较干净可以将洗脱的流速适当增大，但不建议超过3mL/min。将浓缩液转移至氮吹管中，用5 mL 正己烷分三次洗涤鸡心瓶，合并，40℃氮吹吹至0.5mL， 再加入5mL正己烷，氮吹至体积小于1mL，添加40 uL内标液，混匀，供 GC/MS 检测。 3.4固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科Fotector Plus/Fotector 02HT 固相萃取柱 C18 & GCB/NH，固相萃取柱 淋洗 乙腈：甲苯(v：v， 3： 1) 洗脱 乙腈：甲苯(v：v， 3： 1) No Step Source Output Flowrate(mL/min) Volume(mL) Time(min) 1 Rinse Sample Path C2H3N 60 5 1.5 2 Condition C2H3N Wastel 5 10 2.6 3 Load Sample Collect 3 15 6.1 4 Rinse C2H3N Collect 3 15 5.7 5 Air Push Wastel 20 10 1.3 6 End Tube MaxVolume(ml) 50.0 Tube Rack Type Tube Rack(Low Solvent ACN ConcentratedVolume(ml) 20.0 Concentrated Gas Pressure(psi) 4.2 Temperature (℃) 50.0 Needle Follow Needle Revise Speed (mm/min) 1.3 Param(mm) 70 ConcentratedTime (min) 60.0 Operating Mode Countdown Co 图-1第一次净化固相萃取步骤 图-2浓缩仪氮吹步骤 No Step Source Output Flowrate(mL/min) Volume(mL) Time(min) 1 Rinse Syringe C2H3N+C7H8(3：1) 30 3 0.5 2 Rinse Sample Path C2H3N 60 3 1.3 3 Condition C2H3N+C7H8(3：1) Waste1 5 5 1.4 4 Load Sample Collect 1 3 3.5 5 Rinse Sample Tubes C2H3N+C7H8(3：1) Collect 60 5 5.9 6 Rinse Sample Tubes C2H3N+C7H8(3：1) Collect 60 5 5.9 7 Rinse Sample Tubes C2H3N+C7H8(3：1) Collect 60 5 5.9 8 Rinse C2H3N+C7H8(3：1) Collect 1 10 10.5 9 Air Push Waste1 30 10 1.1 10 End 图-3. Fotector Plus 第二步净化详细步骤 4.1色谱条件 进样量：1uL；进样口温度：280℃；进样模式：不分流进样 分流出口吹扫流量：60mL/min， 0.75 min 分流出口打开；隔垫吹扫流量：3mL/min； 载气节省模式：20 mL/min， 等待时间 2 min；载气：氦气流速=1.0 mL/min 进样量：1uL。 升温程序：初温40℃保持 1 min， 以 30C/min升温到130℃保持1min， 再以5℃/min 升温到250℃，再以10℃/min 升到300℃，保持5 min。 4.2质谱条件 离子源温度：230C，质量分析器温度：150℃，辅助加热：280℃ 采集方式：选择离子监测模式(SIM)；电子倍增器电压：相对电压200V，总电压1671V 各组分保留时间以及定量、定性离子如表-1所示： 标准品配置采用 Auto Prep 200全自动液体样品处理工作站进行配置。 表-1.78种农药的定性定量离子及保留时间表 名称 分组 检出限 混标浓度 RT (min) 定量离子 定性离子 甲拌磷 五氯硝基苯 二嗪磷 地虫硫磷艾氏剂 乙烯菌核利 β-六六六甲霜灵 毒死蜱 甲基对硫磷 AAAAAAAAAA 0.0063 0.0125 0.00630.00630.01250.00630.0063 0.0188 0.0063 0.025 2.552.52.552.52.57.52.5 10 15.46 16.75 17.14 17.3119.6720.29 20.31 20.67 20.96 20.82 260 295304246263285219 206 314 263 121/231/153 237/249179/137 137/174/202 265/293/329212/198 217/181/254 249/234 258/286 233/246/200 4.3定性及定量分析 待测样品中，检出的色谱峰保留时间与标准图谱相一致；进行背景扣除后，定量离子、定性离子都出现；定量离子与定性离子的比值需要与标准品中的比值保持一致，如果样品定量离子的相对丰度为标准品的50%以上，允许±10%偏差；相对丰度 5.样品测试 5.1 基质效应验证 取空白样品，按照上述的步骤进行样品处理后，加入标准使用液，定容成1mL， 供 GC/MS-MS 检测，作为基质标准工作曲线计算。 选择定量离子的峰面积作为纵坐标，浓度作为横坐标，做相关曲线，曲线为线性回归，各点权重相等，拟合出工作曲线，要求R>0.99；此曲线两周需要重新配置一次。 为20~50%，允许±15%偏差；相对丰度为10~20%，允许±20%偏差；相对丰度为小于10%，允许±50%偏差； 如果不能确证，将样品进行 GC/MS/MS 上面进行确认。 5.2基质加标回收实验 以苹果为基质样品，进行样品基质加标回收实验，添加高浓度样品、中浓度样品、低浓度样品进行固相萃取净化，测试其回收率及精确度(n=6)详细的测试数据见下表。 高浓度加标试验回收率的相对标准偏差需要小于20%，中浓度与低浓度加标试验回收率的相对标准偏差需要小于30%。 A组化合物工作曲线范围、相关系数、回收率以及相对标准偏差 检测项目 基质标准工作曲线 工作曲线相关系数 加标水平 相对标准偏差 回收率 相关范围(ug/L) R² (mg/kg) 0.005 6.60% 73.1% 94.7% 甲拌磷 50.0-500 >0.99 0.01 7.13% 82.3% - 89.0% 0.025 3.40% 87.7% - 99.1% 0.0125 4.45% 90.3% - 100.1% 氟酰胺 50-750 ≥0.99 0.0250 11.40% 78.3% - 100.2% 0.0625 3.29% 80.4% 87.2% 0.02 8.16% 80.4% - 100.1% 稻丰散 100-1500 ≥0.99 0.04 4.30% 94.6% 105.4% 0.1 3.77% 113.6% 121.4% 0.005 5.95% 92.3% - 103.1% β-六六六 50.0-500 ≥0.99 0.01 8.79% 93.8% 104.8% 0.025 8.55% 84.5% - 97.1% 0.01 7.00% 62.2% - 69.4% 五氯硝基苯 100-1000 ≥0.99 0.02 9.10% 61.9% - 69.6% 0.05 5.72% 62.1% 69.7% 0.005 6.73% 72.7% - 84.4% 地虫硫磷 50.0-500 ≥0.99 0.01 8.10% 80.8% - 87.7% 0.025 9.78% 76.4% 一 80.3% 0.005 5.12% 82.1% - 91.5% 二嗪磷 50.0-500 ≥0.99 0.01 9.79% 82.8% - 87.9% 0.025 5.50% 78.0% - 84.8% 8-六六六 ≥0.99 0.005 8.72% 77.4% - 83.1% 50.0-500 0.01 3.02% 87.1% - 89.1% B组化合物工作曲线范围、相关系数、回收率以及相对标准偏差 检测项目 基质标准工作曲线相关范围(ug/L) 工作曲线相关系数R² 加标水平(mg/kg) 相对标准偏差 回收率 0.1 0.02 0.040.10.020.040.10.020.040.1 0.04 0.008 0.02 5.93% 7.47% 2.82% 7.53% 9.48% 6.14%2.97%3.05% 7.54% 9.67 10.12 5.51 5.59% 93.7% 108.5% 丁草胺 多效唑 硫丹硫酸盐 咪鲜胺 100-1500 100-1500 100-1500 200-3000 ≥0.99 >0.99 ≥0.99 ≥0.99 99.1% 121.2%109.2% - 117.5%96.2% 112.3%90.0% 一 117.2%87.5% 113.7%110.1% 119.3%117.0% - 125.3%102.4% - 121.3%88.6% - 116.7%90.5% 122.1%120.3% 134.8%110.4% - 124.5% C组化合物工作曲线范围、相关系数、回收率以及相对标准偏差 检测项目 基质标准工作曲线 工作曲线相关系数 加标水平 相对标准偏差 回收率 相关范围(ug/L) R (mg/kg) 0.01 5.18% 39.61% 45.93% 敌敌畏 100-1000 ≥0.99 0.02 12.75% 41.61% 58.73% 0.05 6.84% 44.61% - 52.03% 0.005 5.48% 85.51% - 95.73% 仲丁威 50.0-500 ≥0.99 0.01 2.89% 80.91% - 86.93% 0.025 2.15% 80.81% 85.53% 0.005 4.38% 87.11% - 97.43% y-六六六 50.0-500 ≥0.99 0.01 2.79% 85.61% - 91.83% 0.025 1.48% 82.91% 85.93% 0.005 4.80% 83.71% - 93.33% 嘧霉胺 50.0-500 ≥0.99 0.01 4.14% 80.01% 89.23% 0.025 3.02% 80.21% - 87.73% 0.01 4.06% 81.21% - 89.13% 氯唑磷 100-1000 ≥0.99 0.02 3.41% 79.21% - 86.83% 0.05 3.01% 81.71% 89.33% 0.01 6.00% 72.11% 82.73% 七氯 100-1000 ≥0.99 0.02 3.85% 65.91% - 73.23% 0.05 6.63% 62.71% 73.43% 0.005 3.97% 86.01% - 94.93% op'-DDE 50.0-500 ≥0.99 0.01 4.90% 81.31% 92.63% 0.025 3.36% 83.81% - 92.53% 高效氯氟氰菊 0.005 7.87% 77.11% - 91.73% 50.0-500 ≥0.99 0.01 5.98% 72.51% - 85.43% 酯 0.025 3.82% 84.21% - 92.63% 0.005 2.55% 90.31% 95.83% 氯菊酯 50.0-500 ≥0.99 0.01 6.24% 85.31% - 100.03% 0.025 5.16% 90.01% - 104.53% 3.71% 70.31% - 79.23% 4.13% 73.01% - 81.33%82.91% 92.93%74.51% - 84.73% 0.02 4.59% 75.11% 84.73% 0.05 4.15% 85.31% 95.13% 0.02 6.98% 70.5% - 84.7% 2.82% 72.3% - 74.8% 0.10 2.31% 65.9% - 68.7% 7.00% 3.18% 127.3% -- 140.5% 0.1 3.92% 156% - 172.7% 0.01 4.56% 93.2% - 101.6% 1.26% 98.2% - 102.0% 2.99%4.36% 110.4% - 117.3%85.3% - 92.4% 0.08 3.26% 78.3% - 80.4% 0.2 6.35% 检测项目 基质标准工作曲线相关范围(ug/L) 工作曲线相关系数R² ≥0.99 加标水平 相对标准偏差 2.68% 回收率 88.61% 95.03%85.61% 0.04 (mg/kg) 1.84% 氯菊酯 醚菊酯 氟氰戊菊酯-1 氟氰戊菊酯-2 S-氰戊菊酯 苯醚甲环唑 哒螨灵 乙霉威 三唑醇 醚菌酯 50.0-500 50.0-500 100-1000 100-1000 150-1500 200-2000 50-750 400-3000 100-1500 50-750 ≥0.99 ≥0.99 ≥0.99 ≥0.99 ≥0.99 >0.99 >0.99 ≥0.99 ≥0.99 ≥0.99 0.10.01 5.49% 4.95% 4.49% 5.49% 6.13% 3.41% D组化合物工作曲线范围、相关系数、回收率以及相对标准偏差 检测项目 基质标准工作曲线相关范围(ug/L) 工作曲线相关系数R2 加标水平(mg/kg) 相对标准偏差 回收率 异丙威-1 异丙威-2 抗蚜威 乙草胺 100-1000 100-1000 100-1000 100-1000 ≥0.99 ≥0.99 >0.99 ≥0.99 0.01 0.020.050.010.020.050.01 0.02 0.05 0.01 4.38% 6.63% 4.63% 4.53%4.34%3.63% 7.71% 2.10% 4.56% 5.88% 80.32% 89.56%77.32% 91.26%80.62% 89.86%78.02% - 88.16%79.62% - 89.96%86.42% 93.96%80.82% 97.86%90.82% 95.86%89.42% 98.86%73.12% - 83.56% 检测项目 基质标准工作曲线相关范围(ug/L) 工作曲线相关系数R² 加标水平(mg/kg) 相对标准偏差 回收率 0.02 0.050.010.020.050.010.020.05 0.025 0.05 0.125 0.02 0.04 0.1 2.74% 5.70% 3.46% 2.68% 2.57%3.04%2.94% 1.07% 4.63% 2.96% 1.38% 6.20% 3.17% 2.69% 83.02% 88.76%87.22% 97.76%92.52% - 100.36%92.92% - 99.46%94.72% - 100.46%91.22% - 97.56%93.12% - 99.56%98.12% - 100.06%65.82% - 74.36%73.12% - 79.16%80.52% - 82.56%77.22% 92.66%85.32% 92.86%82.62% - 87.26% 精甲霜灵 水胺硫磷 氟虫腈 异菌脲 100-1000 100-1000 250-2500 200-2000 ≥0.99 ≥0.99 ≥0.99 ≥0.99 E组化合物工作曲线范围、相关系数、回收率以及相对标准偏差 检测项目 基质标准工作曲线 工作曲线相关系数 加标水平 相对标准偏差 回收率 相关范围(ug/L) R² (mg/kg) 0.02 5.05% 74.6% 82.4% 炔苯酰草胺 100-1500 >0.99 0.04 1.55% 91.4% - 94.5% 0.1 8.60% 101.0% 121.8% 0.02 3.92% 84.5% - 92.4% 精甲霜灵 100-1500 >0.99 0.04 3.08% 85.6% - 94.8% 0.1 8.64% 83.9% - 99.7% 0.02 3.77% 71.4% - 77.3 苯酰草胺 100-1500 ≥0.99 0.04 5.05% 66.75% - 74.3 0.1 1.67 66.7% - 67.2% 0.04 5.79% 72.5% - 82.8% 噻呋酰胺 200-3000 ≥0.99 0.08 3.98% 81.35% - 89.0% 0.2 7.90% 85.9% - 100.9% 0.04 6.41 73.2% - 84.8% 虫螨腈 200-3000 ≥0.99 0.08 4.08% 85.8% - 93.5% 0.2 6.83% 83.1% - 97.0% 0.02 3.13% 85.1% 92.1% 肟菌酯 100-1500 ≥0.99 0.04 4.00% 76.3% - 85.2% 0.1 4.05% 62.2% - 68.4% 0.04 2.34 78.4% - 82.4% 联苯肼酯 200-3000 20.99 0.08 2.25% 77.2% 81.4% 0.2 4.73% 71.6% - 79.3% 0.04 9.03% 62.4% 78.8% 吡唑醚菌酯 200-3000 ≥0.99 0.08 4.73% 59.9% - 66.7% 0.2 8.09% 57.2% 67.6% 6.结果与讨论 6.1基质干扰回收率 由于蔬菜水果样品中存在的基质大多为强极性的醇类化合物，采用石墨化碳柱净化能除去大部分干扰物，但仍可能洗脱一部分杂质，因此需要考虑样品基质效应干扰，推荐进行样品基质效应确认，详细方法见步骤5.1。 6.2常见问题以及解决方案 6.2.1固相萃取净化步骤误差 分取不准确，前处理过程中需要准确量取以及分取乙腈的体积，不准确会造成回收率偏低或者偏高。固相萃取过程中的损失，主要体现在强极性化合物上。 不同品牌的固相萃取柱的柱效有差异，活化或者上样、洗脱过程中固相萃取柱中的溶液流干，造成固相萃取柱柱效下降；洗脱至最后约2mL的洗脱液不应该收集，因在干柱过程中大量杂质被洗脱。 固相萃取柱的柱效差或者填料量不足，造成杂质无法完全在固相萃取柱上吸附。如果柱效过高则强极性化合物有可能无法被完全洗脱而造成回收下降；净化效果不理想固相萃取过程中上样速度过快，杂质没有完全吸附在固相萃取柱上。 7.解决方案的优势： 本方法可实现蔬菜水果中多种农药以及相关化学品残留样品提取和净化前处理过程自动化，将称量好的样品样品溶剂放置于离心管中，通过AH-30全自动均质仪进行均质萃取，其均质刀头可设置上下蠕动，使其均质完全，保证萃取效果；经均质提取完的萃取液通过 Fotector Plus 全自动固相萃取仪对其进行净化，可设置仪器柱插杠下压高度，在固相萃取柱上方填充 2cm无水硫酸钠，其高效性以及良好平行性，实现多种农药净化要求；洗 6.2.2浓缩过程中损失 目标化合物多为半挥发性有机物，过快或者过于剧烈的浓缩会造成目标化合物气化，主要原因为旋转蒸发过程转速过高，没有选择合适容积的鸡心瓶(样品的体积不能超过鸡心瓶容量的1/2)；氮吹时气流量过大，样品吹溅起后沾在液面上方的瓶壁上，气化进行空气被氮气流带走；转溶不彻底，目标化合物在不同定容液中的响应值存在差异，而在正己烷中的响应值最高，因此转溶不彻底则有可能会影响样品的响应。 6.2.3基质的影响 基质会对化合物进行增强或者抑制，一般情况下需要做同种基质的基质加标，如果样品种类较杂，则需要选取有代表性的作为基质加标测试。 6.3检测仪器常见问题 没有使用新的进样瓶垫片，造成后续样品的体积越来越小，浓度增高，主要表现在质控样的响应值越来越高，应使用新的垫片进样；噪音过大或者响应值低，保留时间重现性差、峰拖尾严重与峰宽过大。 脱液通过 Auto EVA-60 平行浓缩仪进行浓缩，实现60个样品同时进行浓缩，加快浓缩速度，提高实验效率；多种农药中间液、使用液、混标的配制以及替代物、内标物的添加，均可通过 Auto Prep200全自动液体样品处理工作站所内置储存的方法，精准配制多种农药混标的标准工作曲线，轻松地解决混标配制，忘加、少加、多加的烦恼，顺利完成标准液的配制任务。 全自动均质器样品提取 全自动固相萃取仪样品净化 全自动浓缩仪样品浓缩 邮箱： info@raykol.com热线：址：： www.raykol.com 热线： 网址： www.raykol.com邮箱： info@raykol.com 本应用文章参考GB 23200.8-2016《食品安全国家标准粮谷中475种农药及相关化学品残留量测定气相色谱-质谱法》，采用C18及GCB/NH2 柱进行净化气相色谱/质谱联用技术检测，建立了复杂蔬菜水果样品基质中对多种农残方案高灵敏度的前处理和检测分析方法。蔬菜水果样品使用乙腈进行均质提取，经盐析、离心后，取上清液，经石墨化碳黑与氨基柱串接固相萃取净化，用甲苯+乙腈（1+3）洗脱农药以及相关化学品，洗脱后经过溶剂交换，供GC/MS检测，以环氧七氯为内标，采用内标法定量。