肉制品中丹诺沙星检测方案(固相萃取仪)

Raykol Applications Collection-RKFT-F002 全自动固相萃取-高效液相色谱法串联质谱测定肉制品中16种沙星和18种磺胺 1.介绍 沙星类 (Quinones， QNs)抗生素(图-1)是一类人工合成的新型杀菌性抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性以 及毒副作用小、价格低廉等特点，被大量用于治疗和预防水生动物疾病及促生长。 依诺沙星 奥比沙星 沙拉沙星 司帕沙星 图-1.16种沙星类抗生素的结构式 磺胺类药物(Sulfonamides，SAs)(图-2)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物。兽医临床和畜牧养殖业中常将磺胺类药物作为饲料添加剂或动物疾病治疗药物广泛应用。但是磺胺药会引起人过敏性反应，且可能有致癌性，随着社会的发展，磺胺类药物的不合理使用，使其在 动物性食品中残留引起生态环境污染和人类健康危害的潜在威胁已备受关注，如存在的毒副作用，可使人产生脱敏性皮炎，肠胃问题，造血及肾脏损伤等，成为人类亟待解决的问题之一。养殖场及屠宰场的废水常含有高浓度的磺胺类药物残留，因此对于动物源性样品中磺胺的检测需求日益增大。 .C HH2N、 2 N、 H2N H2N、OH2N、N：N= N ~NC S H2NN-s°NH2S N N S HH磺胺醋酰 磺胺嘧啶 磺胺噻唑 磺胺吡啶 磺胺甲基嘧啶 甲氧卞卞(TMP)H2N、 H2N、 H2N、 H2N、 H2N、 oH2N、 OOON .ONNN O o NNSCIN=SNN- S SO H O H N W OHSI 磺胺6-甲氧基嘧啶 磺胺对甲氧嘧啶 磺胺甲氧哒嗪 磺胺氯哒嗪 磺胺间二甲氧嘧啶 磺胺邻二甲氧嘧啶 H2N H2N、 H2N、 H2N H2N、 H2N. N- H2N NN-N N-o O?-N SN H O N N S O NN- W H CW H N O 磺胺二甲嘧啶 磺胺甲噻二唑 磺胺甲基异噁唑 磺胺二甲噁唑 磺胺二甲氧基噁唑 磺胺喹噁啉 磺胺苯吡唑 图-2.19种磺胺类抗生素结构图 本方案参考国标 GB/T20366-2006《动物源产品中喹诺酮类残留量的测定液相色谱-串联质谱法》和国标 GB/T 20759-2006《畜禽肉中十六种磺胺类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》的前处理方法，采用乙腈溶剂对目标化合物进行提取。但是 国标中净化方法过于简单，只是进行简单的除脂，目标提取液中仍含有大量的样品基质，容易干扰后续的液质测试。所以本方案采用 HLB 柱对目标提取液进行了有效的净化，使得整个检测结果更加具有平行性与可靠性。 关键字：全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；沙星类；磺胺类 高效液相色谱 (HPLC) Agilent 1260，质谱检测器(MS) Agilent 6410 或相当 氮气吹干装置： Raykol AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪 HLB固相萃取柱(CNW， 500 mg/6 mL) 3.样品制备及前处理 3.1提取 准确称取搅碎后的动物源性样品 5.0g于50mL离心瓶中，加入2.0g无水硫酸钠，加入20 mL乙腈进行提取，均质1.0 min， 3800转离心5.0 min，重复一次。取上清液于50mL离心管中，加入15mL正己烷，振摇20次，弃去正己烷层，如果油脂仍较多，重复进行正己烷除脂。将所得乙腈溶液于全自动浓缩仪上浓缩至近宿(30℃，5 psi)，加入10mLNazEDTA (0.1 mol/L)-McIlvaine (0.1M)缓冲溶液(pH4.0)摇匀备用。 3.2固相萃取净化 分别以5 mL甲醇和5 mL甲酸水溶液(pH4.0)活化 HLB 柱(Oasis 500 mg，6mL)后，将上述的样品溶液以 2 mL/min 的速度进行上样，并用3mL的甲酸水溶液(pH4.0)溶液清洗样品瓶。以20% NazEDTA (0.1 mol/L)-MCIlvaine(0.1M)缓冲溶液(pH4.0)， 准确 60.2g乙二胺四乙酸二钠，磷酸氢二钠 17.8 g 和柠檬酸 21.0 g 与烧杯中，加入1000 mL 的纯净水，加入浓盐酸调节 pH 值至4.0。如果该缓冲液在放置过程中易析出晶体，那么请将浓度减半进行配制。 的甲醇甲酸水溶液(pH4.0)对固相萃取柱进行淋洗除去残留的无机盐和残留基质。在 20 psi 的氮气流下吹干 HLB 柱，最后以10 mL的甲醇洗脱目标化合物(具体的净化步骤请见图-3)。将所得洗脱液在浓缩仪 AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪上进行吹干，氮气压力为 5 psi， 温度为30℃，浓缩至近干，加入10%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)定容至1mL：上机测试。 3.3固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科Fotector Plus/AutoSPE Plus 固相萃取柱 HLB(Waters， Oasis， 500 mg/6 mL) 活化 甲醇 淋洗 pH 4.0甲酸水溶液 洗脱 甲醇溶液 序号 命令 溶剂 排出 流速[mL/min) 体积(mL) 时间[minJ 1 清洗样品通道 CH30H 60 5 1.5 2 活化 CH30H 废液1 5 5 1.4 3 活化 pH4.0 Form... 废液1 4 5 1.7 4 上样 废液1 3 10 4.1 5 清洗样品瓶 pH4.0 Form... 废液1 60 3 1.8 6 淋洗 Methol (20%... 废液1 5 5 1.4 7 气推 废液1 10 10 1.8 8 吹干 10 9 清洗注射泵 CH30H 40 2 0.4 10 洗脱 CH30H 收集 2 10 5.6 11 气推 收集 10 5 1.1 12 结束 图-3. Fotector Plus全自动固相萃取仪固相萃取净化方法 4.检测条件 4.1色谱柱条件 柱子 流速 流动相 柱温 进样体积 检测器 离子模式 吹扫气 氮气温度 簇电压 雾化压力 梯度洗脱 Waters XBridge BEH HILIC 2.5 pmx21 mm×50 mm 0.200 mL/min A： 10mM ammonium acetic (0.1% formic acid)， B： Methanol 35°C 10 pL Agilent 6410 ESI 11 L/min 350°C 4000 35 psi 沙星类：0.0-1.0 min， 90%的流动相 A； 1.0-4.0 min， 50%的流动相；50%流动相A 保持 2 min； 6.01-7.01 min， 90%的流动相 A； 7.01-10.0 min， 90%的流动相A 保持3 min。 磺胺类：0.0-1.5 min， 93%的流动相A； 1.5-3.0 min， 60%的流动相A； 3.0-3.5 min， 10%的流动相A， 保持 2 min； 5.50-6.0 min， 93%的流动相A； 6.00-10.0 min， 93%的流动相A。 4.2 MRM 参数 表-1.16种沙星类抗生素串联质谱检测参数 Compound Name Precursor Ion Product Ion Dwell Fragmentor Collision Energy Cell Accelerator Voltage 依诺沙星 321.2 303.2 20 125 7 232.1 20 125 氟罗沙星 370.0 370.0 20 135 13 7 326.2 20 135 25 7 诺氟沙星 320.2 302.2 20 130 18 7 233.1 20 130 22 7 362.2 318.2 20 140 16 7 氧氟沙星 261.1 20 140 26 7 334.2 316.2 20 145 18 7 培氟沙星 290.3 20 145 14 7 332.2 314.2 20 125 18 7 环丙沙星 231.1 20 125 40 7 352.3 308.2 20 120 14 7 洛美沙星 265.1 20 120 22 7 358.2 340.2 20 135 20 7 丹诺沙星 255.1 20 135 42 7 360.2 342.2 20 135 20 7 恩诺沙星 316.2 20 135 16 7 396.4 396 20 135 21 7 奥比沙星 295.1 20 135 37 7 386.2 342.2 20 125 18 7 沙拉沙星 299.2 20 125 30 7 双氟沙星 400.2 356.3 20 135 18 7 299.1 20 135 30 7 393.3 349.3 20 150 18 7 司帕沙星 292.2 20 150 26 7 氟甲喹 262.1 262.1 20 105 13 7 244.1 20 105 33 7 噁喹酸 262.2 262 20 100 13 7 244 20 100 29 7 萘啶酸 233.2 233 20 90 9 7 215.1 20 90 25 7 表-2.18种磺胺类抗生素串联质谱检测参数 Compound Name Precursor ion Product lon Dwell Fragmentor Collision Energy Cell Accelerator Voltage 155.9 15 63 9 4 磺胺醋酰 215 108 15 63 17 4 251 185.1 15 103 13 4 磺胺嘧啶 156 15 103 9 4 256 156 15 98 9 4 磺胺噻唑 108.1 15 98 21 4 磺胺吡啶 250 184.1 15 107 13 4 155.9 15 107 13 磺胺甲基嘧啶 265 172 15 102 13 4 156 15 102 13 4 甲基苄胺 291 261.1 15 142 21 4 230.1 15 142 21 磺胺二甲基嘧啶 279 186 15 107 13 4 155.9 15 107 13 4 磺胺甲噻噁唑 271 156 15 88 9 4 108 15 88 21 4 磺胺对甲氧嘧啶 281.1 126 15 112 21 4 磺胺6-甲氧基嘧啶 281 215.1 15 117 13 4 156 15 117 13 4 281 156 15 107 13 4 磺胺甲氧哒嗪 108 15 107 25 4 磺胺氯哒嗪 285 156 15 98 9 4 108.1 15 98 21 4 311.1 245.1 15 127 13 4 磺胺间二甲氧基嘧啶 156 15 127 17 4 311 156 15 117 13 4 磺胺邻二甲氧基嘧啶 108 15 117 25 4 磺胺甲基异噁唑 254 156 15 103 13 4 147.1 15 103 9 4 磺胺二甲基噁唑 268 156 15 105 12 4 113.1 15 105 20 4 磺胺苯吡唑 315 158 15 130 10 4 159 15 130 17 4 4.3色谱图 下图为16种沙星类抗生素的标准品在液质上的色谱图： 图-4.16种沙星类抗生素的保留时间与色谱图 下图为18种磺胺类化合物标准品在液质上的色谱图： 图-5.18种磺胺类抗生素的保留时间与色谱图 5.1基质效应验证 取空白样品，按照上述的样品处理步骤，加入标准使用液(1 ppm， 20 pL)， 定容1mL， 供LC/MS-MS检测，工作曲线计算。如果基质加标浓度准确，则可以直接用标准曲线对样品进行定量；如果不准确，请使用基质加标做工作曲线进行定量。 选择定量离子的峰面积作为纵坐标，浓度作为横坐标，做相关曲线，曲线为线性回归，各点权重相等，拟合出工作曲线，要求R>0.99；此曲线两周需要重新配置一次。 5.2 样品基质加标测试 为了验证该方法的回收率，本实验向空白猪肉样品(5g)中分别加入上述16种抗生素类标准品(20uL， 1 mg/L，n=4)和19种磺胺类抗生素(20uL， 1 mg/L， n=3)进行加标回收验证。测试结果如表-3和表-4所示，16种抗生素回收率在 82.1-95%之间，19种磺胺类抗生素的回收率在77-95%之间。说明该方法能够很好地运用于动物源性样品中 16种抗生素类标准品和19种磺胺类抗生素的检测。 表-3.动物肉制品中的加标回收率及 RSD 值 (40 pg/kg) 化合物 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 平均回收率 样品-1 样品-2 样品-3 样品-4 Average RSD(%) (Compound) Sample-1 Sample-2 Sample-3 Sample-4 Recoveries(%) 伊诺沙星 79.19 83.90 87.55 93.05 85.92 6.82 氟罗沙星 81.92 82.88 86.77 92.46 86.01 5.56 诺氟沙星 95.93 83.79 104.05 93.87 94.41 8.83 氧氟沙星 83.78 83.70 90.62 88.27 86.59 3.96 培氟沙星 96.26 88.60 99.10 95.31 94.82 4.69 环丙沙星 86.06 80.45 94.96 90.50 87.99 7.05 洛美沙星 74.20 81.65 77.98 95.38 82.30 11.22 丹诺沙星 84.64 79.41 89.02 85.00 84.52 4.67 恩诺沙星 79.85 82.26 86.53 84.14 83.19 3.41 奥比沙星 92.61 100.04 81.03 96.77 92.61 8.96 沙拉沙星 82.43 89.91 104.67 97.31 93.58 10.22 双氟沙星 78.91 88.30 97.19 89.37 88.44 8.47 司帕沙星 88.20 80.15 86.39 81.70 84.11 4.52 氟甲喹 79.77 88.47 75.89 87.20 82.84 7.26 噁喹酸 78.77 88.47 79.89 87.20 83.59 5.93 萘啶酸 92.26 87.57 82.64 91.29 88.44 4.93 表-4.19种磺胺的加标回收率及 RSD值(50ng/L) 化合物 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 平均回收率 样品-1 样品-2 样品-3 Average RSD (%) (Compound) Sample-1 Sample-2 Sample-3 Recoveries (%) 磺胺醋酰 101.36 85.04 80.83 89.08 12.17 磺胺嘧啶 97.67 80.82 81.12 86.54 11.14 磺胺噻唑 95.59 87.27 82.01 88.29 7.75 磺胺吡啶 99.44 89.13 86.31 91.63 7.54 磺胺甲基嘧啶 92.89 84.50 84.78 87.39 5.45 甲基苄胺 97.27 89.24 87.22 91.25 5.83 磺胺二甲嘧啶 94.02 87.77 84.89 88.89 5.25 磺胺甲噻噁唑 92.77 84.78 83.41 86.99 5.81 磺胺对甲氧基嘧啶 93.25 88.79 87.59 89.88 3.32 磺胺邻甲氧嘧啶 91.64 87.29 82.25 87.06 5.40 磺胺甲氧哒嗪 92.10 85.41 80.74 86.09 6.63 磺胺氯哒嗪 87.86 83.50 80.97 84.11 4.15 磺胺间二甲氧嘧啶 97.13 90.29 81.86 89.76 8.53 磺胺邻二甲氧嘧啶 102.92 96.92 87.91 95.92 7.88 磺胺甲基异噁唑 91.23 89.34 85.72 88.76 3.15 磺胺二甲基噁唑 88.69 88.64 84.53 87.29 2.73 磺胺二甲氧基噁唑 86.25 77.93 68.67 77.62 11.33 磺胺喹噁啉 91.03 86.70 82.55 86.76 4.89 磺胺苯吡唑 101.36 85.04 80.83 89.08 12.17 6.结果与讨论 6.1动物肉制品中基质成分复杂，应采用20%的酸化甲醇进行淋洗，，可以有效地除去部分杂质，降低样品分析步骤的基质抑制效应，避免样品测试不平行情况的出现。 6.2洗脱液氮吹应至近干，磺胺和沙星类化合物的回收率稳定。但氮吹时间过长，样品浓缩干燥， 7.仪器特征优势 本方法可实现样品前处理从提取到分析全程自动化，实验过程中只需称取样品、加入溶剂、样品架的转移，其他步骤均可进行样品前处理全自动化，提取过程是将样品及溶剂放置离心管，通过AH-30全自动均质器进行均质提取，其快速提取、无交叉污染以及连续性进行使得实验室人员摆脱手动均质的束缚；提取液通过 Fotector Plus 全自动 则待测化合物可能以固态颗粒的形式随着氮吹气流飞走而损失。 6.3样品分析中，个别样品如肝脏等基质过于复杂样品，可以直接采用基质工作曲线进行目标物的定量分析，以避免液质分析的基质效应。 固相萃取仪进行净化，解放实验室人员，轻松解决样品量多的问题；样品架的兼容性，避免样品多次转移过程，洗脱液便可直接转移至 Auto EVA-60全自动平行浓缩仪进行平行浓缩，不仅减少样品转移造成的损失，而且可节约实验室人员时间，大大提升实验工作效率。 Ra Raykol 全自动均质器样品提取 全自动固相萃取仪样品净化 全自动浓缩仪样品浓缩 热线：箱： info@raykol.com网址：： www.raykol.com 本方案参考国标GB/T 20366-2006《动物源产品中喹诺酮类残留量的测定液相色谱-串联质谱法》和国标GB/T 20759-2006《畜禽肉中十六种磺胺类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》的前处理方法，采用乙腈溶剂对目标化合物进行提取。但是国标中净化方法过于简单，只是进行简单的除脂，目标提取液中仍含有大量的样品基质，容易干扰后续的液质测试。所以本方案采用HLB柱对目标提取液进行了有效的净化，使得整个检测结果更加具有平行性与可靠性。