食用油、大豆、酱油中黄曲霉毒素B1检测方案(固相萃取仪)

Raykol Applications Collection-RKFT-F001 全自动固相萃取-高效液相质谱联用法测定食用油、大豆和酱油中的黄曲霉毒素B族和G族 采用 Raykol Fotector Plus 全自动固相萃取仪进行食品中黄曲霉毒素的免疫亲和法净化，试样经 过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。10 mL 水淋洗将免疫亲和柱上的杂质除去，以甲醇洗脱免疫亲和柱，用甲醇定容后，目标化合物通过带有三重四级杆质谱检测器的高效液相色谱仪测定。 图-1.4种黄曲霉毒素的结构式 本应用文章参考 GB 5009.22-2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》中第一法，采用免疫亲和柱净化，，高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)联用技术检测，建立了复杂粮油 样品基质中黄曲霉毒素高灵敏度的前处理和分析方法，得到四种常见粮油样品中黄曲霉毒素的加标回收率在 85-110%之间。 关键字：全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱法；黄曲霉毒素；B族G族 2.仪器、耗材 Raykol Fotector Plus 全自动固相萃取仪，黄曲霉毒素免疫亲和柱(Romer， 60 mg/3 mL) 高效液相色谱：(HPLC)Agilent 1260 质谱检测器：(MS) Agilent 6410 氮气吹干装置： Raykol AutoEVA-60全自动平 3.样品提取与前处理 3.1花生油样品前处理 准确称取5g花生油(市售)于50 mL 离心管中，加入1-2g氯化钠及甲醇-水溶液(20mL， 7：3，v/v)，均质2 min 后，离心5 min(转速3800 r/min)。取下层提取液(上下层视具体油脂样品而定)定性滤纸氏过滤，准确移取滤液4 mL至80mL玻璃上样管，加入40 mL PBS 缓冲溶液(pH7.40)稀释，待 行浓缩仪Raykol AH-30 全自动均质器Raykol Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站 用。 3.2大豆类样品 准确称取5g大豆类谷物于50 mL 离心管中，加入1-2g氯化钠及甲醇-水溶液(20mL， 7：3，v/v)，均质2 min 后，离心5 min(转速3800 r/min)。取上清液定性滤纸过滤，准确移取滤液4mL至80mL 玻璃上样管，加入40 mL PBS 缓冲溶液稀释， 热线：400-885-1816 待用。 3.3酱油类样品 准确称取 5g 酱油于50 mL 离心管中，加入1-2g氯化钠及甲醇-水溶液(7：3，v/v)定容至 25 mL，均质2 min 后，离心5 min (转速3800 r/min)。取全部溶液定性滤纸过滤(过滤至一半溶液即可)，准确移取滤液 5 mL至80 mL玻璃上样管，加入40mL PBS 缓冲溶液稀释，待用。 3.4空白样品 以提取溶剂作为空白样品，与样品同步进行相同的前处理。 3.5固相萃取净化条件 mL PBS 缓冲溶液润洗样品瓶，10mL水淋洗，，气推50mL吹干免疫亲和柱，推速为160 mL/min；最后以1 mL的甲醇，以0.3 mL/min的速度洗脱样品，以1mL的去离子水快速洗脱，收集结束后加入去离子定容至2mL，备用。详细步骤见图-2。( FotectorPlus 上下位机软件版本在 v2.21以上) 表-1.固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科 Fotector Plus/Fotector-02HT 固相萃取柱 黄曲霉毒素免疫亲和柱 (Romer，60 mg/3mL) 淋洗 纯水 洗脱 甲醇 以3 mL/min 的速度精确上样46 mL 待测液，5 序号 命令 溶剂 排出 流速[mL/min) 体积(mL) 时间Cmin) 1 清洗样品通道 CH30H 40 5 1.7 2 填充样品路径 0.01M PBS 50 2 1.2 3 特殊上样 废液1 3 46 17.9 4 清洗样品瓶 0.01M PBS 废液1 80 5 2.6 5 淋洗 H20 废液1 10 5 0.9 6 气推 废液1 160 50 3.1 7 清洗注射泵 CH30H 80 1 0.3 8 洗脱 CH30H 收集 5 0.7 0.5 9 气推 收集 0.3 2 7.1 10 洗脱 H20 收集 20 0.7 0.4 11 气推 收集 10 2 0.6 12 结束 图-2. Fotector Plus 黄曲霉毒素的免疫亲和净化方法 4.检测条件 4.1 HPLC-MS/MS 条件： 表-2.黄曲霉毒素的液质检测条件 色谱柱 流速 流动相 柱温 进样体积 离子模式 吹扫气 Waters XBridge BEH HILIC 2.5 umx2.1 mmx50 mm 0.300 mL/min A： 10mM ammonium acetic (0.1% formic acid)， B： Methanol 30°C 10 pL ESI 11 L/min www.raykol.com 邮箱： info@raykol.com 氮气温度 350°C 簇电压 4000V 雾化压力 35psi 梯度洗脱 甲醇，10mM乙酸铵水溶液为流动相(梯度洗脱，起始10%起醇保持 1min， 4 min 内升至90%的甲醇， 保持2min， 然后降至10%，保留8min)。 4.2 MRM 参数： 表-3.4种黄曲霉毒素的串联质谱检测参数 化合物 保留时间(min) 定量离子对(碰撞能量eV、锥孔电压V) 定性离子(碰撞能量eV、锥孔电压V) 黄曲霉毒素G， 5.241 331.2>331.2(25，7) 331.2>285(30，7) 黄曲霉毒素B， 5.425 315.2>287.1(25，7) 315.2>259.2(30，7) 黄曲霉毒素G 5.433 329.2>243.0(25，7) 329.2>214.2(35，7) 黄曲霉毒素B 5.605 313.2>285.1(20，7) 313.2>241(40，7) 图-3.4种黄曲霉毒素的 MRM色谱图 5.样品测试 5.1油样加标测试 油样因为保存不当，常被真菌污染，导致其黄曲霉毒素含量超标，因此对油样中黄曲霉毒素检测存在迫切需要。现取空白油样5g， 添加 50 uL 的黄 曲霉毒素G2、B2G和B的标准品(c，100 ng/mL)，进行上述步骤的前处理净化，样品回收率如下表-4所示： 表-4.添加水平为5u g/kg 油样中的回收率结果 名称 回收率(%) 平均回收率 RSD(%) 1 2 3 (%) 黄曲霉毒素 Gz 100.0 101.8 100.4 100.8 0.9 黄曲霉毒素B， 102.5 107.2 102.9 104.2 2.5 黄曲霉毒素G 101.9 104.1 103.9 103.3 1.1 黄曲霉毒素B 97.2 98.6 97.0 97.6 0.8 5.2谷物类加标测试 大豆类谷物中添加水平为 1 ug/kg 的黄曲霉毒素 G2、B2、Gi和Bi的回收率结果： 表-5.添加水平为1 ng/kg 大豆样品中的回收率结果 名称 回收率(%) 平均回收率 RSD(%) 1 2 3 (%) 黄曲霉毒素G， 112.2 106.1 106.9 108.4 3.1 黄曲霉毒素B， 91.4 109.8 97.4 99.6 9.4 黄曲霉毒素G 113.7 113.2 97.3 108.1 8.6 黄曲霉毒素B 104.3 96.4 100.1 100.3 4.0 5.3酱油样品加标测试 酱油中添加水平为 1 ug/kg 的黄曲霉毒素 G2、B2、Gi和B的回收率结果： 表-6.添加水平为1ug/kg 酱油样的的回收率结果 名称 回收率(%) 平均回收率 RSD(%) 1 2 3 (%) 黄曲霉毒素G， 107.9 98.4 98.9 101.7 5.3 黄曲霉毒素B， 111.3 104.3 102.1 105.9 4.5 黄曲霉毒素G 106.9 106.4 100.2 104.5 3.6 黄曲霉毒素B 109.0 108.7 97.8 105.2 6.0 6.结果与讨论 6.1样品提取液pH对回收率的影响 不采用 PBS 缓冲液进行样品稀释，改用纯水稀释样品提取液，进行上述净化步骤，酱油样品中的加标回收率降为60-70%，若采用 pH=8.0的缓冲液进行样品提取液稀释，样品回收率降为70-80%，样品间的回收率也大为降低。因此需要加入 PBS 缓冲液(pH7.4)进行样品的上样环境 pH 的调节。 6.2淋洗溶剂对回收率的影响 淋洗以 5 mL 的 PBS 缓冲液和10 mL 的纯水除 7.注意事项 7.1油样预处理中过滤应快速过滤，不可让油样透过滤纸进入提取液中，影响免疫亲和柱的吸附。 7.2谷物中离心完成后，不可放置过长时间，否则谷物容易重新吸水，可能导致提取液的浓度过高，使样品的回收率偏高，影响测试结果。 8.特点及优势 去免疫亲和柱上残留的色素和基质，以免液质检测时产生基质抑制。若不进行适当的淋洗，3平行样品平行性降低明显， RSD 值将提升至10%以上。 6.3洗脱速度与洗脱量的影响 洗脱量以1 mL 为宜。采用1 mL/min 的洗脱速度，洗脱效果不佳，回收率在 50-70%；继续降低洗脱速度至0.5 mL/min，洗脱效果有明显提升，回收率在70-90%；继续降低洗脱速度至0.2-0.3 mL/min，回收率可稳定在90-110%之间。 7.3固相萃取进行提取液净化前，特别对于偏酸或偏碱性样品，应用 PBS 缓冲溶液(pH=7.4)进行稀释后上机，否则可能会导致回收率偏低。 7.4进样瓶中的样品，不可放置过长时间，否则测试样品可能变质，导致回收率偏低。 本方法可实现样品前处理全程自动化，从样品 制备到分析检测整个过程，提取过程只需将样品及 溶剂置于离心管中，通过 AH-30 全自动均质器进行快速提取，其多重清洗模式可消除样品间的交叉污染。提取液通过 Fotector Plus 全自动固相萃取仪进行净化，该设备可实现免疫亲和柱自动脱帽，告别手动脱帽和人员看守的烦恼，快速高效地完成净化任务(30min，6个样；5h，60个样品)；该步洗脱液可直接放置在 EVA-60 全自动浓缩仪进行平行浓 缩，减少样品损失，节约实验室人员时间，大大提升实验工作效率；最后可通过睿科仪器 Auto Prep200全自动液体样品处理工作站内置储存的方法，轻松解决标准中间液、使用液的配制以及替代物、内标物心添加，精准配制黄曲霉毒素标准曲线，配制过程全自动化，只需准备好溶剂以及标液放置于仪器中，便可顺利完成配制任务。 RyK RyKel 全自动均质器均质提取 全自动固相萃取仪免疫亲和柱净化 全自动浓缩仪浓缩定容 全自动液体样品处理工作站标准曲线配制 网址： www.raykol.com 邮箱： info@raykol.com 邮箱： info@raykol.com热线：址：www.raykol.com 本应用文章参考GB 5009.22-2016《食品中黄曲霉毒素B族和G 族的测定》中第一法，采用免疫亲和柱净化，高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）联用技术检测，建立了复杂粮油样品基质中黄曲霉毒素高灵敏度的前处理和分析方法，得到四种常见粮油样品中黄曲霉毒素的加标回收率在85-110%之间。