血浆中有机酸/醇、氨基酸、糖与糖醇、甾醇类等主要代谢物检测方案(气质联用仪)

TSQ 8000 GC-MS/MS在代谢组学研究中的应用策略 吴泽明李春丽赛默飞世尔科技(中国)有限公司 1..前言 代谢物组的化学种类复杂性与理化性质多样性需要用不同分析技术间的互补性来克服， GC-MS 技术因此成为代谢组学研究中的重要测试平台。按照目标层次的不同，代谢组学可以粗略地概括为两大类：非靶向全组分代谢指纹分析(untargeted metabolic profiling analysis) 与代谢靶标分析(metabolitetarget analysis)。前者多受科学发现模式所驱动(scientific discovery-driven)，在对生物体系中的代谢物信息进行巨细靡遗地充分表征基础上，着眼于通过发现差异性表达代谢物，来揭示代谢表型转变背后蕴含的生物学信息；而后者往往表现为科学假设驱动模式(scientific hypothesis-driven)，实验之前已经通过生物背景信息分析或者出于验证确证的需要 (validation/verification)，确立了所要关注的特定代谢物群。传统 GC-MS 技术长于代谢指纹分析，但囿于有限的定量功能而短于代谢靶标分析。GC-MS/MS恰恰可以弥补GC-MS 的技术局限性，能够集全扫描相对定量与SRM、SIM(多反应监测、选择离子扫描)靶标绝对定量于一体，可以更好地满足代谢组学不同层次的研究需求，是代谢组学测试平台的发展前沿。 本研究利用赛默飞科技最新的串联气质平台 TSQ 8000 GC-MS/MS， 建立了从全组分代谢指纹分析到靶标分析的应用策略(图1)。首先，实验通过全扫描相对定量分析，比较了对照组与疾病组间的人血浆代谢轮廓差异。随后，针对潜在生物标记物建立了绝对定量方法，开展代谢靶标分析，以之作为生物验证实验的基础。TSQ 8000 GC-MS/MS具有灵敏度高、重现性好、线性范围宽、谱图匹配度高、定量准确等特点，同时它还具有独特的真空锁定功能，能不泄真空进行快速的离子源清洗维护，这使得它在代谢组学研究中具有广阔的应用空间。 图 1 TSQ 8000 GC-MS/MS 在代谢组学研究中的应用策略 2. 实验部分 2.1 GC-MS(MS/MS)条件 TRACE 1310 GC +TSQ 8000 MS/MS system(Thermo Scientific， USA) 进样口温度270℃，分流模式 进样体积1pL 分流流量 10 mL/min 分流比 5：1 He载气流速 1.0 mL/min， 恒流模式 柱温程序升温梯度：度始70℃，维持5 min 后，5℃/min升温至220℃并维持2min，继10℃/min快速升至320℃， 维持 10 min 毛细管柱TG-5MS (30 mx0.25 mm ID×0.25 um) 离子传输线温度320℃ 离子源温度300℃ ·EI电离电压-70eV 发射电流50uA Full scan： Q3全扫描质量范围 m/z 15-500， 扫描时间200 ms SRM：：分辨率Q1 0.7 Da (FWHM)， CID氩气，， 1 mTorr 2.2样品制备与衍生 采用文献报道方法进行血浆代谢物提取与衍生，简单描述为：100 pL 血浆用250乙腈沉淀蛋白，离心取上清，减压干燥后，提取物依次使用盐酸甲氧胺-吡啶溶液与 MSTFA 进行肟化与硅烷化衍生。 2.3全组分代谢指纹分析 图2为TSQ 8000 全扫描模式(Full scan)采集到的血浆代谢指纹典型谱图。有机酸/醇、氨基酸、糖与糖醇、甾醇类等主要代谢物的色谱分布如图示。按照图11汤流程，首先对全组分代谢指纹数据进行表型分类研究。利用ProteoWizard (http：//proteowizard.sourceforge.net)将 XCalibur RAW 文件转换为 mzXML 格式，随后在R语言下运行 XCMS程序，进行峰提取、色谱匹配、缺失值补充等操作1。面积归一化转换后，进行主成分分析(PCA)建模，结果见图3a，可知对照组与疾病组间的血浆代谢物组差异显著。XCMS提取代谢特征的火山图如图 3b，发现两组之间差异显著的特征后，通过AMDIS 解卷积与 NIST 谱库检索，，可以鉴定一系列潜在生物标记物。TSQ8000 GC-MS/MS 全扫描时具有理想的谱图匹配度，例如，图4为尿素硅烷化衍生物的谱库检索结果，相似度SI与 RSI值均大于900。 图 2 TSQ 8000GC-MS/MS 全扫描血浆代谢指纹谱 图3(a)非靶向全组分代谢指纹分析的 PCA 结果， (b)代谢特征的火山图 图4尿素的 NIST 谱库检索检索(上：样品实测谱图，下：标准谱图) 2.4标记物的靶标代谢分析 全组分代谢指纹分析之外，往往需要用靶标分析来开展生物标志物或是特定代谢通路的验证/确证实验。本研究以全组分指纹分析确定的潜在生物标志物为靶标，通过 TSQ 8000 GC-MS/MS 的自动 SRM 分析方法开发功能(Auto-SRM)来建立定时反应监测定量方法(tSRM， Timed-SRM)，测定潜在生物标记物在血浆中的绝对含量，作为下一步生物学验证实验的基础数据(表1)。Auto-SRM 能自动进行 SRMR transition 母离子与子离子选择、碰撞能量优化等操作， tSRM 方法编辑不需要设定 time segments， 减少离子驻留时间(dwell time)的浪费，进一步提高方法的灵敏度，能保证复杂生物样品中多目标成分定量时采集到足够的数据点，具有更加优异的效果，同时使方法更简单易行。 表1采用 TSQ8000 tSRM 方法定量测定部分潜在生物标记物 Metabolites Derivative Rt/min SRM transitions Collision for Quan Energy/V Valine 2TMS 14.19 144.16→73.1 10 Glycerol 3TMS 16.04 205.13→147.1 10 Glutamine 3TMS 28.18 245.18→156.1 15 Tryptophan 3TMS 36.88 291.2→100.7 10 Palmitoylglycerol 2TMS 41.78 313.28→218.14 10 Myo-inositol 6TMS 34.73 305.17→217.14 10 Leucine 2TMS 15.84 158.17-102.1 15 soleucine 2TMS 16.45 158.16→73.1 15 Ribitol 5TMS 29.98 217.14→129.1 15 Aspartic acid 3TMS 22.49 232.16→100.11 10 TMS： trimethylsilyl，三甲基硅烷化衍生产物 3.结论 TSQ 8000 GC-MS/MS 丰富的功能适用于代谢组学、生物分析研究领域，其创新的 Auto-SRM 与定时 SRM 功能使得 SRM 方法的开发与编辑更简易，对生物学家而言，高度准确特异的绝对定量数据的获取将更轻松。 一方面，它可以胜任从非靶向全组分代谢指纹分析发现生物标记物到生物验证靶向绝对定量的科学需求。 ●另一方面，它可以用于针对特定代谢通路的代谢物靶向定量分析，通过 SIM与 SRM 方法的灵敏度来拓展对神经递质等极痕量代谢物的表征能力。 [参考文献] 1.(C.A. Smith， et al. Anal Chem. 2006 Feb 1；78(3)：779-87. 代谢物组的化学种类复杂性与理化性质多样性需要用不同分析技术间的互补性来克服， GC-MS 技术因此成为代谢组学研究中的重要测试平台。按照目标层次的不同，代谢组学可以粗略地概括为两大类：非靶向全组分代谢指纹分析（untargeted metabolic profiling analysis）与代谢靶标分析（metabolitetarget analysis）。前者多受科学发现模式所驱动（scientific discovery-driven），在对生物体系中的代谢物信息进行巨细靡遗地充分表征基础上，着眼于通过发现差异性表达代谢物，来揭示代谢表型转变背后蕴含的生物学信息；而后者往往表现为科学假设驱动模式（scientific hypothesis-driven），实验之前已经通过生物背景信息分析或者出于验证确证的需要（validation/verification），确立了所要关注的特定代谢物群。传统GC-MS 技术长于代谢指纹分析，但囿于有限的定量功能而短于代谢靶标分析。GC-MS/MS 恰恰可以弥补GC-MS 的技术局限性，能够集全扫描相对定量与SRM、SIM（多反应监测、选择离子扫描）靶标绝对定量于一体，可以更好地满足代谢组学不同层次的研究需求，是代谢组学测试平台的发展前沿。本研究利用赛默飞科技最新的串联气质平台TSQ 8000 GC-MS/MS，建立了从全组分代谢指纹分析到靶标分析的应用策略（图1）。首先，实验通过全扫描相对定量分析，比较了对照组与疾病组间的人血浆代谢轮廓差异。随后，针对潜在生物标记物建立了绝对定量方法，开展代谢靶标分析，以之作为生物验证实验的基础。TSQ 8000 GC-MS/MS 具有灵敏度高、重现性好、线性范围宽、谱图匹配度高、定量准确等特点，同时它还具有独特的真空锁定功能，能不泄真空进行快速的离子源清洗维护，这使得它在代谢组学研究中具有广阔的应用空间。