酒中真假鉴别检测方案(红外光谱仪)

白皮书 普通的苏格兰威士忌 红外/近红外/紫外/可见光谱分析法 作者： Ian Robertson Seer Green， UK 用于威士忌真假鉴别的分子光谱技术的对比 简介 据英国消费者杂志《Which?》估算，英 国的假冒食品市场规模为70亿英镑/年 (2011年)。这说明英国零售业和餐饮业在售的10%食品并非由食品包装所示成分制成。这一点也可从英国食品标准局(FSA)最近10年的一系列食品欺诈起诉案例得到证实。例如，2003年，英国食品标准局在大米抽样检查中发现46%的印度香米存在以次充好的情况；2007年，哈洛德百货(Harrods) 和桑斯博里超市(Sainsburys)(及其他)被查到正在销售假冒的野生鲑鱼(即养殖鲑鱼)。英国食品标准局的调查发现，抽检的“野生”海鲈鱼和海鲷鱼中有1/10实际上人工养殖的，而抽检的“野生"鲑鱼中则有1/7是人工养殖的。上述检测主要局限于产品的DNA检测。经济合作与发展组织(简称“经合组织")的报告显示，2007年"造假率"最高的产品为酒、猕猴桃、奶粉和婴儿食品。欧洲烈酒组织(CEPS) 表示，酒类品牌仿冒和相关知识产权侵权行为导致劣质酒甚至毒酒充斥市场，严重危害消费者的身体健康。此外，这些不法行为不仅损害了制酒行业，而且也影响了政府收入，如正规产品交易产生的税收收入等。该组织估算中国在售的洋酒中有四分之一实际上是假冒 商品。目前，酒类产品的鉴别依赖于耗时费力的实验室检测技术—―目前尚无可用于酒类鉴 别的快速筛选检测方法。 分子光谱分析技术特别适用于快速筛查，其优点在于成本较低，操作容易，结果快速准确。分子光谱分析技术并不局限于实验室的各类物品，无需使用气体、溶剂等。近年来，移动式或便携式分子光谱分析技术的出现已经使实验室筛选结果更接近于测量点或现场检测结果。在威士忌真伪鉴别方面，已有多项分子光谱分析技术问世，这些技术均有助于假冒威士忌的检测。本文旨在研究分子光谱分析技术在威士忌真伪鉴别方面的应用潜力，并推荐几种适用于鉴别酒类造假的小型化检测方法。 1.红外光谱分析法 红外光谱可分为三个不同区域： 远红外区：主要用于测量重原子与无机材料，故不适用于上述样本类型。 -远红外区，通常定义的光谱波数范围为400 cm²1 ~20 cm²-中红外区，通常定义的光谱波数范围为4000 cm丫1~400 cm -近红外区，通常定义的光谱波数范围为14000 cm1~4000 cm-1 中红外光谱分析法用于观察分子内的基频振动，并将产生可作为各类材料“指纹”的光谱。 近红外区吸收带由中红外区观测到的基频振动产生的倍频带与合频带构成。近红外区的吸收带大大弱于基频振动吸收带。 本研究使用中红外/近红外光谱分析法鉴别威士忌样本真假。 中/近红外光谱区液体取样技术概述 中红外/近红外光谱分析法可采用多种采样技术，通常分为两类：A.透射采样技术；B.反射采样技术。 采用透射采样技术时，仪器将测量穿过样本的辐射量。比如未被样本吸收的辐射量。 图1透射采样技术 将液体样本放入配有合适窗口材料的液体池，其窗口材料根据相应的红外光谱区配备。中红外区的液体池光程一般为0.005 mm~0.1 mm(5-100微米)，近红外区的液体池光程一般为 0.05 mm~10 mm。 采用反射采样技术时，仪器将测量样本反射的辐射量。反射采样技术，尤其是镜面反射采样或漫反射采样，属于可用于连续固体、粉末和浆料采样的表面取样技术。一般情况下，液体不会反射太多的红外线辐射。对于液体(如威士忌)的红外光谱分析法而言，最适合的反射采样技术是衰减全反射技术(ATR)。 采用衰减全反射技术时，样本放于合适晶体材料的上表面。红外光束从晶体上表面穿过晶体，并在内部发生反射。 图2衰减全反射 在被反射回晶体和红外探测器之前，隐失波将从晶体表面穿透入样本，穿透深度不大，但足以产生材料的红外光谱。采样衰减全反射技术测量时，样本的光穿透样品的有效光程一般为0.5~20微米，具体取决于晶体种类和晶体内反射次数。正因如此，衰减全反射技术特别适用于中红外区的检测。然而，由于近红外区的吸收带大大弱于中红外区的吸收带，衰减全反射采样技术不适用于近红外区。 用于威士忌真伪鉴别的红外透射检测 将威士忌样本注入氟化钙窗片光程为0.05 mm的红外液体池，采集波数范围跨越了中红外区和近红外区可达7800cm1 图3所有送检样本的透射光谱 当光程为0.05 mm时，很大部分的中红外区为水的强吸收带，大致波数范围为1640 cm²1至3400 cm²1。近红外区的较弱吸收带更适合用于含水样本的分析。在近红外区内，可能观察到水(波数为5167 cm1)和乙醇(波数范围为4420 cm²-4300 cm1)的合频带。这两种成分决定了威士忌的总体光谱范围。中红外区是材料鉴别的最佳光谱区。由于当光程为0.05 mm时，很大部分的中红外区为水的强吸收带，故而，该区难以用于确定其他成分。当光程短于0.05 mm时，水带的强度减弱，其他成分的强度也同样减弱。因此，不建议使用透射测量法进行威士忌真伪研究。但是，近红外区的透射光谱为酒精饮料中乙醇含量的定量测量提供了可能。 制备一系列乙醇浓度范围为0-0.8克/毫升的乙醇和水的标准混合物。在氟化钙窗片光程为0.05 mm (50微米)的红外液体池，通过四次扫描采集到分辨率为4 cm²1的光谱。 图5放大的透身光谱(近红外区)。 采用偏最小二乘法(PLS1)，进行上述标准混合物的定量校准。校准包括通过一阶导数数据和三种降噪系数的其中一种确定7300-4000cm²l范围内的波数数据。软件计算显示，模型需要两个主成分。采用“留一法”进行模型的交叉验证。 图6乙醇/水标准混合物的一阶导数光谱 图7SEP模型校准曲线 图8乙醇浓度的校准曲线 图9乙醇浓度的交叉验证曲线 使用定量模型检测一系列“掺假"威士忌样本。样本EO是一种市售的苏格兰威士忌。其他所有样本都是样本EO和一系列摻假的混合物。样本E1和样本E2加入了超纯水稀释，故其酒精含量特别低。剩余的样本掺入乙醇、其他类型的苏格兰威士忌或非苏格兰产威士忌的酒精饮料。因此，他们的酒精含量接近原威士忌酒。 酒精含量的定量测量 表1定量测量结果 样本名称 乙醇浓度(g/mL) E0 0.3218 E1 0.2396 E2 0.1642 E3 0.3221 E4 0.3224 E5 0.3187 E6 0.3224 E7 0.3221 E8 0.3227 E9 0.3109 E10 0.3220 结果显示，定量测量能够检测出酒精含量被稀释的威士忌，但无法检测出掺假但酒精含量与原酒一致的威士忌。 威士忌的直接衰减全反射测量 如本文前面段落所述，采用衰减全反射技术进行采样时，需将样本放置在衰减全反射采样附件内适合红外光谱分析的晶体材料的上表面，入射辐射产生的隐失波穿透样本，样本反射的辐射产生红外光谱。因此，衰减全反射技术是测量材料红外光谱的一种非常快速和简单的方法，但其缺点在于该 技术只能触及材料的表面，单次衰减全反射附件的光线穿透深度(即有效光程)仅为0.5-2微米。这大大短于透射测量的一般光程(25-200微米)。 此处展示了某一威士忌样本、乙醇和水的衰减全反射光谱。由于水和乙醇是威士忌的主要成分，因此，威士忌的衰减全反射光谱取决于水和乙醇的光谱特征。 图10威士忌(上)、乙醇(中)和水(下)的衰减全反射光谱 由于其他成分的光谱特征非常弱，因此，仅从样本置于晶体之上所获衰减全反射数据，很难分辨威士忌的真伪。为此，需将衰减全反射附件加热至65℃，使威士忌内的水和乙醇蒸发，只留下其他成分。实验显示，威士忌内的水和乙醇在150秒后蒸发完成，只剩下其他成分。具体过程如图11所示。 图11为了定量一致性，所有样本的检测量均为10uL 首先，将样本置于衰减全反射晶体，获得由所有成分的光谱构成的混合光谱；接着，蒸发乙醇，获得由样本中水的光谱为主的混合光谱；再次，蒸发水，只留下其余成分的干燥残留物 图12蒸发过程中不同时点的光谱(应用比例图表) 上：时间=0，威士忌光谱 中：时间=130秒，乙醇蒸发之后其余成分(以水为主)的光谱下：时间=120秒，水蒸发之后其余成分的光谱 图13蒸发过程各成分的浓度 通过蒸发技术，获得了不含任何残留溶剂的剩余成分的高质单一光谱 剩余成分的衰减全反射测量 其余成分(除乙醇与水之外的成分)的光谱与威士忌所含焦糖色素成分的光谱非常相似，如下图所示： 图14威士忌内剩余成分(上)和焦糖色素样本(下)的光谱 E150a焦糖色素是威士忌的合法添加剂，可使威士忌呈现统一的颜色。衰减全反射技术应能够识别出所使用焦糖色素添加剂的种类。 掺假样本 将一种市售的威士忌作为标准样本，然后以各种方法对标准样本进行摻假，以确认是否可以检测出摻假样本。表2列出了所有的摻假样本。摻假方式包括：加超纯水稀释，加乙醇，加其他各种苏格兰威士忌。 表2掺假样本列表 掺假样本 乙醇含量为40%的标准威士忌样本 混物EO 39.99 用超纯水将标准威士忌样本的乙醇含量稀释到30% 共混物E1―一-掺假样本1 29.74 用超纯水将标准威士忌样本的乙醇含量稀释到20% 共混物E2-一1掺假样本2 19.80 用40%乙醇溶液按50/50比例稀释标威士忌样本 共混物E3-―掺假样本3 40.0 用添加有DD Williamson公司所产标准E150a交谈色素(酒精含量为40.1%)的40%乙醇溶液按50/50比例稀释标准威士忌样本，使混合物在430nm波长情况下的值与基础标准威士忌样本相匹配 共混物E4——掺假样本4 39.96 用其他苏格兰威士忌1按50/50稀绎标准威士忌样本(或其替代物) 共混物E5- 掺假样本5 39.46 用其他苏格兰威士忌2按50/50稀释标准威士忌样本(或其替代物) 共混物E6-―—掺假样本6 39.87 用其他苏格兰威士忌3按50/50稀释标准威士忌样本(或其替代物) 共混物E7—一掺假样本7 39.81 用非苏格兰产威士忌1按50/50稀释标准威士忌样本(或其替代物) 共混物E8——掺假样本8 39.91 用非苏格兰产威士忌2按50/50稀释标准威士忌样本(或其替代物) 共混物E9——掺假样本9 38.32 用非苏格兰产威士忌3按50/50稀释标准威士忌样本(或其替代物)共 共混物E10- -掺假样本10 39.88 本研究测量了EO-E10不同假样本的衰减全反射光谱，具体见下图： 图15黑色- ·标准威士忌样本，蓝色和红色- ·稀释后样本。 剩余- -混合与其他苏格兰或非苏格兰产威士忌的样本。 所有样本的光谱的形状和光谱特征均相似。除了用水或乙醇稀释过的样本外，其他样本的整体光谱强度略有不同。如预期的那样，它们的光谱强度相当弱。样本E4(用水/乙醇稀释，添加额外焦糖色素使其颜色与标准样本一致)的光谱看上去与其他所有样本的光谱非常相似，并不因假而明显不同。 共混物 本研究测量了一系列在售威士忌共混物的衰减全反射光谱，以确定是否可能通过光谱区分这些共混物。所得光谱如图16所示。 图16黑色——共混物A；红色-———1共混物B；绿色- 共混物C；蓝色——共混物D。 图中所示衰减全反射光谱的形状相似，但是总体强度不尽相同。这表明各共混物中焦糖色素和/或其他可溶解非挥发性物质的含量不同。共混物A与共混物B的唯一差别在于酒精含量不同。共混物C与共混物D看起来几乎一样。 采用化学计量法统计光谱数据，可定量识别共混物。使用簇类独立软模式法(SIMCA)计算共混物数据，其结果显示：不同共混物分离成模型内的不同类物质。 图17显示威士忌共混物样本分离的簇类独立软模式法图 这一系列实验使用的非苏格兰产酒类样本可分出两种类别： a) 非苏格兰产威士忌 b) 其他非苏格兰产烈酒不同产地的一系列威士忌样本的衰减全反射光谱如下所示： 图18非苏格兰产威士忌样本A、B、C、F、H、I与苏格兰威士忌共混体(都是威士忌)的衰减全反射光谱一 苏格兰威士忌共混体的光谱强度最强。 本图所列苏格兰威士忌共混体光谱应作为比较对象。其他威士忌的其余成分(即除水和乙醇以外的其余成分)的光谱明显有别于苏格兰威士忌共混体的其余成分的光谱。光谱较弱，这说明其余成分较少。光谱形状不同，说明其他威士忌的其余成分有别于苏格兰威士忌共混体的其余成分。目前来看，法国威士忌(黑色光谱)与其他威士忌最为不同，而西班牙威士忌(蓝色光谱)中其余成分的含量最少。—系列其他非苏格兰产烈酒的光谱如下所示： 图19非苏格兰产烈酒D、E、G、J、K、L和苏格兰威士忌共混物的光谱——苏格兰威士忌共混物的光谱强度最弱，约为1060cm'。D-黄金朗姆酒；E-一一一邑白兰地； G一—龙舌兰酒；J——波本威士忌；K- 黄金朗姆酒2；L- 干邑白兰地2。 本图所列苏格兰威士忌共混体光谱应作为比较对象。朗姆酒、干邑白兰地、龙舌兰酒和波本威士忌等其他类烈酒的光谱强度均高于苏格兰威士忌共混体的光谱强度，这表明其他类烈酒中其余成分的含量大于苏格兰威士忌共混体中其余成分的含量。波本威士忌的光谱相对较弱，两份干邑白兰地样本的光谱最强。 一系列市售苏格兰威士忌的衰减全反射光谱数据如图20所示。 图20一系列普通苏格兰威士忌样本的衰减全反射光谱 光谱形状全都相似，这表明所有威士忌的成分相似。然而，如同预期的那样，不同品牌威士忌的光谱存在细微差别。光谱强度不同，这说明各个品牌威士忌中其余成分的含量不同。22年威士忌的光谱强度最高。有2组数据来自纯麦威士忌样本。总体而言，所获光谱看起来相似。但是，通过对比纯麦威士忌与图21中其他威士忌样本的导数光谱，仍可发现二者之间的细微差异。 图21普通威士忌样本的二阶导数光谱 红外光谱分析法的摘要 ·近红外透射检测可实现威士忌酒精浓度的精确定量测量 ·所述近红外透射检测使用的是研究级实验室仪器。但是，这种方法也可应用于便携式/手持式近红外光谱仪。 ·威士忌直接衰减全反射测量所得光谱取决于水和乙醇的光谱带，这隐藏了其他成分的光谱特征。 ·市售加热衰减全反射附件可方便地测量烈酒中非挥发性成分的含量： ◆所需样本量：~10uL ·干燥后其余成分的光谱提供了关于样本的有用信息： ◆半定量评估非挥发性物质的含量 ◆能够轻松鉴别苏格兰威士忌和非威士忌烈酒 ◆能够辨别苏格兰威士忌与其他威士忌 ◆能够分辨纯麦威士忌与混合型威士忌 ◆一定程度上能够区分不同种类的混合型苏格兰威士忌 上述衰减全反射测量所使用到的仪器为可用电池供电且可在“现场”运输和部署的小型“便携"台式红外光谱仪。然而，加热后的衰减全反射板需要电源电压供电，因此限制了该测量方案的应用领域。手持或完全便携式仪器的未来发展需要解决加热后的衰减全反射晶体的实施问题。此外，仪器还需确保晶体在蒸发过程中始终处于水平位置。 ·可以检测出某些类型的摻假： ◆添加水或水/乙醇进行稀释 ◆添加非苏格兰产烈酒进行稀释 ◆用混合型威士忌替代纯麦威士忌 ◆但是，通过添加焦糖色素调色后的水/乙醇进行的稀释难以被发现。 2.紫外-可见光谱分析法 紫外-可见光谱分析法(UV/Vis)大致可以涵盖波长介于190nm~800 nm之间的光谱区。此光谱区内吸收带的成因是分子从基态跃迁到激发态。 正常情况下，紫外-可见光谱分析仪是使用单色仪进行后续波长扫描的分散仪表。使用双光束型仪表时，样本的光谱为样本光束与参考光束之间的比值。威士忌等液体样本的取样程序为：将样本注入光程为1 mm~50 mm(最常用的光程为10mm)的石英比色杯中；将纯净水注入等效石英比色杯中，然后照射参考光束。 掺假样本 表2详列的一系列摻假样本可通过紫外-可见光谱分析仪进行测量：将样本注入光程为10mm的石英比色杯中，得到波长范围为230 nm~850 nm的光谱。所采集的光谱如图22所示。 图22掺假威士忌样本的吸收光谱 光谱特征相当宽泛，但并未超出基线弯曲范围。因此，通过数据求导处理消除宽泛的基线特征并突出谱峰是很正常的。相同样本的二阶导数光谱如图23所示，凸显了样本之间的差异。 图23标准共混体(黑色)和掺假样本的二阶导数光谱 从图中光谱可以清楚了解到：当威士忌被水或乙醇稀释后，可以观察到283 nm处的谱峰强度非常弱。当威士忌被另外一种威士忌稀释后，283nm处的谱峰强度可能更强或更弱，这主要取决于用于稀释的威士忌的种类。但是，威士忌与其他任何稀释剂的混合均导致混合后的光谱与标准共混物的光谱有所差异。 共混物 本研究测量了四类不同市售共混物组成的35个样本，以确定是否可以使用紫外/可见光谱分析法区分各个共混物。该分析法所得光谱如图24所示。 图24共混体A(黑色)、共混体B(红色)、共混体C(绿色)、共混体D(蓝色)的二阶导数光谱 共混物A和共混物B显然有别于其他共混物。共混物C与共混物D的光谱存在轻微重叠。SIMCA模型包含所有共混物样本的数据，旨在分离各个共混物。SIMCA模型如图25所示 图25共混物A至共混体D 的SIMCA模型 再次，共混物A和共混物B之间有明显的分离。共混物C与共混物D的光谱存在非常轻微重叠。SIMCA模型表明，共混物C的一个样本与共混物D的样本重叠。所有共混物样本的更大量采集可能有助于改善模型。 非苏格兰产酒类样本 这一系列实验使用的非苏格兰产酒类样本可分出两种类别：a) 其他产地出产的非苏格兰产威士忌 b)其他非苏格兰产烈酒一系列市售非苏格兰产威士忌样本的光谱如图26所示。 图26非苏格兰产威士忌样本A、B、C、F、H、I(都是威士忌)与标准共混体(黑色)的光谱 标准共混体的光谱应作为参考基准，其他所有威士忌样本均不同于标准苏格兰威士忌共混体。光谱图显示出明显的谱带漂移和强度差异。基于这些数据，很容易检测出非苏格兰产威士忌。 市售非威士忌型烈酒的光谱与标准共混物的参考光谱如图27所示。 图27市售非威士忌型烈酒D、E、G、J(非威士忌)与标准共混物(黑色)的光谱，其中， D一—黄金朗姆酒；E一一干邑白兰地；G―一龙舌兰；J—一波本酒。 龙舌兰酒样本的光谱最接近标准共混物的光谱，但所有其他样本的光谱则与标准共混物的光谱存在明显差异。 普通的苏格兰威士忌 本研究测量了一系列市售苏格兰威士忌的紫外-可见光谱。 所测样本的品牌和年份均不相同，其中还包含2个纯麦威士忌样本。测量所得光谱如图28所示。 紫外-可见光谱分析法的摘要 ·紫外-可见光谱分析仪提供了一种快速和简单的威士忌采样方法 ·上述紫外-可见光谱测量使用到的仪器是小型台式实验室仪器。然而，上述测量方法也可应用于便携式/手持式紫外-可见光谱仪。 ·紫外-可见光谱提供了与样本有关的有用信息： ◆能够轻松鉴别苏格兰威士忌和非威士忌烈酒 ◆能够辨别苏格兰威士忌与其他威士忌 ◆能够分辨纯麦威士忌与混合型威士忌 ◆能够区分光谱稍微重叠的不同种混合型苏格兰威士忌 ·可以检测出某些类型的摻假： ◆添加水或水/乙醇进行稀释 ◆添加非苏格兰产烈酒进行稀释 ◆用混合型威士忌替代纯麦威士忌 ◆也可能检测出通过添加焦糖色素调色后的水/乙醇进行的稀释 ( 参考文献 ) 1：http：//www.europeanspirits.org/thelssues/Counterfeiting.asp 图28普通苏格兰威士忌的紫外-可见光谱 除了纯麦威士忌样本与22年威士忌样本外，其他不同样本之间的光谱线型十分相似，即，在280 nm处的谱带强度非常高。 ( 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司 ) ( 地址：上海张江高科技园区张衡路1670号 ) ( 邮编：201203 ) ( 电话：0 2 1-60645888 ) 传真：021-60645999 www.perkinelmer.com.cn PerkinElmer 要获取全球办事处的完整列表，请访问http：//www.perkinelmer.com.cn/AboutUs/ContactUs/ContactUs 目前，酒类产品的鉴别依赖于耗时费力的实验室检测技术——目前尚无可用于酒类鉴别的快速筛选检测方法。分子光谱分析技术特别适用于快速筛查，其优点在于成本较低，操作容易，结果快速准确。分子光谱分析技术并不局限于实验室的各类物品，无需使用气体、溶剂等。近年来，移动式或便携式分子光谱分析技术的出现已经使实验室筛选结果更接近于测量点或现场检测结果。在威士忌真伪鉴别方面，已有多项分子光谱分析技术问世，这些技术均有助于假冒威士忌的检测。本文旨在研究分子光谱分析技术在威士忌真伪鉴别方面的应用潜力，并推荐几种适用于鉴别酒类造假的小型化检测方法。