动物源性食品中雌激素类药物残留检测方案(液质联用仪)

实验结果版权所有 C2016， PerkinElmer， Inc. 保留所有权利。PerkinElmer 是PerkinElmer， Inc. 的注册商标。其它所有商标均为其各自持有者或所有者的财产。 背景 雌激素类药物在畜禽养殖中具有通过蛋白 质同化作用提高食欲的功效，可以用来提高饲料转化率，促进动物生长，对畜牧业生产者具有很大的经济利益诱惑，从而导致畜牧业中滥用雌激素类药物现象非常严重。雌激素类在动物源性食品中有较高的残留，消费者一旦食用含有雌激素残留的动物性食品后，人体内激素平衡会被扰乱，严重危害消费者的健康。乙烯雌酚及其盐类化合物在《中华人民共和国农业部公告第235号》中被列为禁止使用的药物，在动物源性食品中不得检出。欧盟于2007年7月在WTO/TBT 通报中，规定将全面禁止在食源性动物中使用雌甾醇17-β及其衍生物《关于禁止在畜牧业中使用具有激素或甲亢疗效物质以及β-激动药的理事会指令96/22、EC的修正》，在动物源性食品中不得检出。 样品前处理方法提取 称取5 g(精确至0.01 g)混匀的试样，置于50mL具塞离心管中，加入10 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，涡旋混匀，再加入β-葡萄糖醛酸/芳香基硫酸酯酶溶液100 uL， 于37℃±1℃振荡酶解12h。取出冷却至室温，加入25 mL甲醇超声提取 30 min， 0-4℃下10000 r/min 离心 10 min，将上清液转入洁净烧杯中，加入100 mL水，混匀后待净化。 净化方法 ①固相萃取柱的准备： 将 ENVI-Carb 固相萃取柱(500 mg，6 mL)置于固相萃取装置上，依次用6mL二氯甲烷-甲醇溶液(V/v，7：3)、6mL甲醇和6mL水活化。NH，固相萃取柱，采用6mL二氯甲烷-甲醇溶液(v/v， 7：3)活化。 ②样品净化： 将上述样品提取液以 2~3 mL/min 的流速上样于活化过的 ENVI-Carb 固相萃取柱，将净化柱减压抽干。再将活化好的 NH，柱串接在 ENVI-Carb 固相萃取柱下方。用6mL二氯甲烷-甲醇溶液洗脱并收集洗脱液，取下ENVI-Carb 固相萃取柱，在加入2mL二氯甲烷-甲醇溶液洗脱 NH，柱，收集得到的洗脱液在氮气流下吹干，用1mL甲醇-水溶液 (v/v，，11：1)复溶，供LC-MS/MS测定。 液相色谱参数： 液相色谱仪：PPerkinElmer AltusTM A-30 UPLCB系统，具体参数见表1。 表1.液相色谱仪参数表 液相色谱流动相：A：乙腈 B：水(含0.01%氨水) 时间(min) 流速(mL/min) %A %B 1 Initial 0.3 25 75 2 2.5 0.3 60 40 3 4.0 0.3 98 2 4 5.5 0.3 98 2 5 5.6 0.3 25 75 6 7.0 0.3 25 75 色谱柱：PPerkinElmer SPP C18 2.1*50 mm，2.7um(货号：N9308402) 分析时间：7 min； 柱温：35℃ 进样量：10pL 质谱参数： 以下参数以 PerkinElmer QSightTM 200 系列为例，雌激素类化合物质谱参数见表2和表3。 表2.化合物质谱参数 化合物 英文名 CAS 号 定量 离子对 定性 离子对 EV/V CE/eV Dwell Time/ msec 雌三醇 Estradiol 50-27-1 286.8 \170.8 286.8 \144.9 -20 48(60) 30 雌二醇 Estriol 50-28-2 270.8\144.8 270.8\182.8 -20 57 (54) 30 炔雌醇 Ethinylest-radiol 57-63-6 294.8\144.9 294.8 \158.9 -20 57(48) 30 雌酮 Estrone 53-16-7 268.8\144.6 268.8\158.7 -27 50(50) 30 己烯雌酚 Diethystil-bestrol 6898-97-1 266.8\236.8 266.8\250.9 -20 37(35) 30 己烷雌酚 Hexestrol 84-16-2 268.8\118.9 268.8\134 -23 36(27) 30 己二烯雌酚 Dienestrol 84-17-3 264.7\92.7 264.7\170.8 -20 65(21) 30 表3.质谱离子源参数 离子源 电喷雾，负离子模式(ESI-) 离子源喷雾电压 -4500 离子源温度/C 500 HSID温度/C 320 雾化气 160 干燥气 50 按照上述建立的实验条件，获得雌激素类的色谱图，见图1。其中各雌激素类化合物的信息、保留时间见表4。 图1.雌激素标准溶液浓度为 0.2ng/mL 的提取离子流色谱图 表4.图1中雌激素类化合物信息，保留时间 序号 化合物 保留时间 /min 1 雌三醇 1.90 2 雌二醇 3.52 3 炔雌醇 3.80 4 雌酮 3.93 5 己烯雌酚 4.05 6 己烷雌酚 4.13 7 己二烯雌酚 4.15 将标准溶液配制成工作液，使各个化合物浓度为0.1~100ng/mL， 雌三醇浓度为0.5-100 ng/mL， 在本方法确定的实验条件下，获得标准曲线数据。以进样浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，建立标准曲线(图2及表5)。由表5可见，各分析物标准曲线的相关系数均大于0.99，相关性良好。在低浓度水平下0.1 ng/mL (雌三醇为0.5ng/mL)进行重现性实验，在连续6针进样下，获得优异的重现性结果，见表5。 表5雌激素类化合物的标准曲线、线性关系以及重现性数据(0.1 ng/mL) 化合物 标准曲线范围ng/mL 相关系数 R 在0.1 ng/mL 浓度下重现性 n=6 雌三醇 0.5-100 0.998 7.88%(0.5ng/mL) 雌二醇 0.1-100 0.999 6.27% 炔雌醇 0.1-100 0.999 4.26% 雌酮 0.1-100 0.999 5.81% 己烯雌酚 0.1-100 0.997 4.79% 己烷雌酚 0.1-100 0.998 2.86% 己二烯雌酚 0.1-100 0.999 4.11% 结论 PerkinElmer QSightTM 200 系统完全满足动物源性食品中雌激素类的日常检测工作。QSight TM200 系统，离子源具有自清洁功能以及质谱接口 HSID 热源去溶剂技术，提高仪器抗污染能力，从而获得更低的噪音，更低的检测限，从容应对复杂基质的食品安全检测。 ( 1. 国标 GB/T 21981-2008 ) ( PerkinElmer SPP 系列色谱柱订购信息：色谱柱采购直线：021-60645658，021-60645659 ) ( 电子邮件：consumable.china@perkinelmer.com ) 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司 地址：上海每江高科技园区张衡路1670号 邮编：201203 电话：021-60645888 传真：021-60645999 www.perkinelmer.com.cn ( 要获取全球办事处的完整列表，请访问http：//www.perkinelmer.com.cn/AboutUs/ContactUs/ContactUs ) 乙烯雌酚及其盐类化合物在《中华人民共和国农业部公告第235 号》中被列为禁止使用的药物，在动物源性食品中不得检出。欧盟于2007 年7 月在WTO/TBT 通报中，规定将全面禁止在食源性动物中使用雌甾醇17-β 及其衍生物《关于禁止在畜牧业中使用具有激素或甲亢疗效物质以及β- 激动药的理事会指令96/22、EC 的修正》，在动物源性食品中不得检出。本文将介绍动物源性食品中雌激素类药物残留LC-MS/MS分析方法