人参药材中人参皂苷检测方案(快速溶剂萃取)

药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(7)—188 快速溶剂萃取-液相色谱法测定人参药材中人参皂苷的含量 袁斌，车金水，金燕，叶明立 (戴安中国有限公司应用研究中心，上海201203) 摘要 目的：建立快速溶剂萃取(ASE)-液相色谱法测定人参药材中人参皂苷 Re、Rg、Rb，Rc、Rb，Rd。方法：用三氯甲烷脱脂，水饱和正丁醇提取药材中人参皂苷；采用Cs柱，乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，检测波长为203 nm，柱温为35℃，进行含量测定。结果：人参皂苷化合物响应值与进样量呈良好线性关系(r>0.999)，测定精密度 RSD <2.0%。结论：本法操作简便、快速，结果准确，可用于人参药材质量控制。 关键词：快速溶剂萃取；液相色谱；人参；人参皂苷，质量控制 中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：0254-1793(2013)07-0000-00 Determination of ginsenosides in Ginseng Radix et Rhizoma by ASE -HPLC YUAN Bin， CHE Jin-shui，JIN Yan， YE Ming -li (Shanghai Laboratory of Application and Research Center， Dionex China Limited，Shanghai 201203，China) AbstractObjective：To establish an accelerated solvent extraction(ASE) - HPLC method to determine ginsen-osides Re，Rg，Rb，Rc，Rb，，Rd in Ginseng Radix et Rhizoma. Methods：Trichloromethane was used to remove thelipid ingredients and water - saturated butanol solution was adopted to extract the ginsenosides. A Ci8 column withmobile phase of acetonitrile aqueous solution was used，and the contents of ginsenosides were determined at a wave-length of 203 nm with the column compartment set at 35 ℃. Results： The response factor of ginsenosides regardingto the different injections is linear， which generates a satisfactory correlation coefficient(r>0. 999). The methodprecision showed a sound coefficient(RSD% <2.0%). Conclusion：The method is simple，fast and accurate， whichis suitable for quality control of Ginseng Radix et Rhizoma. Key words：ASE；HPLC；Ginseng Radix et Rhizoma； ginsenosides； quality control 人参为五加科植物人参 Panax ginseng C. A.Mey. 的干燥根及根茎，最早出现在《神农本草经》中，记载其具有大补元气、补精益神的功效。在其后的历代医药书籍中均有其功效的记载和大量的临床使用记录。随着现代化学和药理学的综合研究，已经表明其中所含的人参皂苷为其增强人体免疫力，提高血氧量的主要活性成分。中国药典(2010年版一部)采用测定人参药材中人参皂苷的含量来控制人参药材的质量21，但该法中药材样品前处理过程花费时间较长，不利于日常样品测试。快速溶剂萃取(accelerated solvent extraction，ASE)13-71技术利用常见溶剂在加温加压条件下提取样品。在高温高压条件下，溶剂粘度降低，分子扩散增强，提高分子运动能力，使溶剂和溶质分子能够快速渗透和分散， 且溶质分子更易于挣脱基质的束缚。与传统超声提取、索氏提取等样品处理比较，传统萃取技术通常以小时计算，甚至超过24h，但 ASE 技术通常所用时间为10~20 min。同时与其他技术相比，ASE 还可节省50%-90%的溶剂消耗。 ASE 技术已经被国家标准(GB/T 19649-2006)18指定为样品萃取技术。本研究工作中采用 ASE -液相色谱法测定人参药材中人参皂苷的含量，其操作简便，时间短，结果准确。 仪器与试剂 Thermo Fisher 公司 UltiMate3000 液相色谱仪，配低压四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器和Chromeleon变色龙色谱数据管理软件。ThermoFisher 公司 ASE350 快速溶剂萃取仪。 人参药材由山东烟台绿叶制药公司提供，经鉴 定为五加科植物 Panax gingseng C. A. Mey. 的根部。人参皂苷 Re、RgRbjRc、Rb，Rd的对照品购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙享(Fisher公司)为色谱级，纯化水(Millipore公司)，三氯甲烷、正丁醇(国药集团化学有限公司)均为分析纯。 2 实验条件 2.1 快速溶剂萃取 温度：140℃；压力：10MPa；多步萃取程序：①三氯甲烷萃取2次(20 mL·次二)、弃去萃取液，②水饱和正丁醇萃取2次(20mL·次)，收集萃取液；静态循环次数：2 2.2 色谱条件色谱柱：Acclaim° 120 Ci8(4.6mm×250 mm，5 pm)；流动相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0~30 min，21%B；30~65 min，21%B-40%B；65~75min ，40%B→90%B；75~80 min，90%B；80~80.1 min，90%B→21%B；80.1~90 min，21%B)；流速：1.0mL·min-1；检测波长：203nm；柱温：35℃；进样量：10 p.L。 3 结果与讨论 3.1 ASE 提取条件的确定 中国药典(2010年版一部)人参药材中人参皂苷的含量测定方法处理过程耗时长，且操作烦琐。为提高提取效率，决定使用 ASE 技术提取人参皂苷。在ASE 过程中，通过改变温度等试验参数来加速溶剂从样品中提取目标成分，减少样品处理时间。在本实验中，比较了不同温度和循环次数对萃取效果的影响，当温度升至140℃时，提取效率达到最佳，在160℃时，萃取液颜色变深，色谱峰杂质增多，且人参皂苷 Rg、Rb，与 Rd 的含量有所下降，同时色谱图中未知杂质成分增多，因此选择140℃为萃取温度(见图1)。 图1 温度对萃取效率的影响 Fig 1 Temperature effect on extraction 在静态循环时间(5 min)不变的条件下，循环1次时，皂苷萃取量为90%，循环第2次时皂苷提取量约为10%，增加到第3次时，皂苷萃取量则约为2%，即再增加循环次数时，皂苷提取效率无明显增加，见图2。 图2 循环次数对萃取效率的影响 Fig 2(Cycle times effect on extraction 在样品量为1g的条件下，比较了提取溶剂体积为5、10、20、30mL对皂苷提取率的影响，结果表明当溶剂量为20 mL 时皂苷提取效率达到最大值，再增大溶剂体积，皂苷提取效率无明显变化，见图3。 图3 溶剂体积对萃取效率的影响 Fig 3 Solvent volume effect on extraction 通过比较后采用提取温度为140℃，压力为10MPa，静态循环2次的条件提取药材中皂苷化合物，所需溶剂为20 mL，样品处理总时间为30 min。 3.2 色谱分离条件的确定 参考中国药典中人参皂苷的色谱分离条件对人参皂苷Re、RgRbRc、Rb，、Rd 6个皂苷进行分析，分离结果表明在该条件下，其中2个皂苷无法达到基线分离。通过对分离条件的优化后，在本文确定的色谱条件下6个皂苷与相邻峰均可达到基线分离(见图4)，以人参皂苷 Rg峰计算理论塔板数为2800，人参皂苷Rg与相邻色谱峰的分离度为1.7。 3.3 线性关系考察 准确称取人参皂苷Rg、Re、Rb， Rc、Rb， Rd 的对照品各10 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL各含1 mg人参皂苷的混合对照品溶液。精密吸取混合对照品溶液1、5、10、15、20uL，依次进样，在本文确定的色谱条下件进行分析并记录色谱图。以对 图4 对照品(A)及人参药材(B)色谱图 Fig4 HPLC chromatograms of reference substances (A) and Ginseng Radix et Rhizoma(B) 人参皂苷( ginsenosides)：1.Rg 2.Ree3.Rb： 4.Rc 5.Rb， 6.Rd 照品进样量 X(ug)为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，进行线性回归处理。人参皂苷RgRe、RbRc、Rb，Rd进样量在1~20 ug的范围内呈良好线性关系，回归方程分别为： 3.4 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 uL，在本文色谱条件下连续进样6次，记录色谱图。人参皂苷Rg，峰面积的 RSD(n=6)分别为0.45%、0.59%0.23%、0.35%、0.21%、0.16%。 3.5 重复性试验 采用本文确定的 ASE 法平行制备供试品溶液6份，进样测定，测得样品中人参皂苷 Rg、Re、RbRc、Rb，、Rd含量(n=3)分别为1.23、1.47、2.24、1.78、2.56、1.62 mg·g ，RSD 分别为1.7%、1.2%、0.8%、1.2%、1.2%、1.1%。 3.6 加样回收试验 精密称取药材粉末0.5 g，加入混合对照品溶液0.5 mL，室温下挥干溶剂，按本 文确定的 ASE 法制备6份供试溶液，测定人参皂苷的量。计算加样回收率，结果见表1。 3.7 样品测定称取样品粉末(过4号筛)1 g，加入硅藻土约2g，混匀，置20 mL 样品池中，置于快速溶剂萃取仪上，依次用三氯甲烷、水饱和正丁醇按照“2.1”项中萃取条件提取品品中人参皂苷。将正丁醇提取液置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至5 mL 量瓶中，摇匀，即得供试品溶液。精密吸取供试品溶液在本文色谱条件下进样分析。另采用中国药典法2制备供试品溶液，在本文确定的色谱条件下进样分析。将2种方法的测定结果进行统计分析(F检验)比较，结果见表2与表3。在表3中，对于给定α=0.05条件下，F值(2.596)小于临界Ｆ值(5.318)，表明2种样品处理方法在对药材中目标成分的提取效果没有明显差异，但从表2中得知ASE 方法较药典的样品处理方法所需时间少，从而提高效率，故可用 ASE 联合液相色谱方法来检测人参药材中人参皂苷的含量。 表1 加样回收率实验(n=6)Tab l Study of recovery tests 人参皂苷 含量 加入量 平均回收率 RSD/% (ginsenosides) ( (content)/mg g ( (added)/mg (average recovery)/% Rgi 0.652 0.522 102.7 1.2 Re 0.733 0.536 99.3 1.2 Rb， 1.122 0. 511 100.4 0.8 Rc 0.886 0.508 102.8 1.2 Rb 1.246 0.521 101.9 0.8 Rd 0.813 0.511 99.6 1.1 表2 中国药典提取法与 ASE提取法的结果比较(mg·g，n=5) Tab 2 Results comparison of ChP extractionmethod and ASE extraction method 人参皂苷 ASE 提取法 中国药典提取法 (ginsenosides) ( ASE extraction method) (ChP extraction method) Rgl 1.23 1.22 Re 1.45 1.46 Rb1 2.26 2.25 Rc 1.78 1.76 Rb2 2.55 2.54 Rd 1.63 1.62 总量(total) 10.90 10.85 所需时间(elapsed time)/h 0.5 16 表3 .不同提取方法的人参皂苷总量方差分析结果(n=5) Tab 3 ANOVA results of total ginsenosides fromdifferent extraction methods SUMMARY Groups Count Sum Average Variance ASE 提取法 5 54.42 10.884 0.00083 ( ASE extraction method) 中国药典提取法 5 54.28 10.856 0.00068 ( ChP extraction method) 方差分析(ANOVA) 方差来源 (source of variation) SS df MS F P-value Fcrit 组间(between groups) 0.001961 0.00196 2.596 0.146 5.318 组内(within groups) 0.006048 0.000755 总和(total) 0.008 9 4 结论 ASE 技术在加压加温条件下进行样品提取，其优势在于：在提取过程中溶剂始终保持液态，保证其与样品有最大接触面积，且溶剂粘度降低易于进入样品基质，同时在高温条件下分子运动能力提高，扩散加强，从而加速提取过程，提高萃取效率。本法采用ASE 方法提取人参药材中皂苷化合物，与中国药典的样品处理方法比较，其样品处理时间由传统前处理所需16h 降低到快速萃取仅需约0.5 h，大幅度提高样品处理效率，而分析结果无明显较大差别。因此，快速溶剂萃取可用于人参等天然产物中活性成分的提取。 ( 参考文献 ) ( 1 L I Tai - ping(李泰平). 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