中药材中氨基酸检测方案(氨基酸分析仪)

2007，16(1)福建分析测试 Fujian Analysis & Testing37 维普资讯 http：//www.cqvip.com福建分析测试 技术交流382007，16(1) 柱前衍生与柱后衍生法检测紫芝药材中氨基酸 陈丽艳 陈体强 徐洁 (1.福州市药品品验所，福州350007； 2.福建省农业科学院， 福州350003) 摘 要：采用柱前衍生法和柱后衍生法测定紫芝药材中氨基酸成分，分析氨基酸分析仪(离子交换色谱分离-柱后衍生)和高效液相色谱仪(柱前衍生-反相液相色谱分离)在氨基酸测定上存在的异同。结果表明两种方法在测定同一样品时，在丝氨酸、异亮氨酸和脯氨酸等组分检测上的差异显著。 关键词：紫芝；氨基酸；柱前衍生-反相液相色谱；离子交换色谱-柱后衍生 中图分类号：0657.32 R931.6 文献标识码：A 文章编号：1009-8143(2007)01-0037-03 Analysis and Comparison of Amino acids in the Fruitbodyof Wild and Log-cultivated Linzhi in Fujian Chen Liyan Chen Tiqiang’Xu jie (1. Fuzhou City Institute for Drug Control， Fuzhou 350009， China； 2. Fijian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou 350013 ，China) Abstract：Pre - column and post - column derivation methods were applied to analyse the amino acids in Zizli medicinalmaterials ( Ganoderma sinense). The similarities and differences of amino acids analyses between HPCEC(high performancecation -exchange chromatography with post - colum derivation and spectrophtometric detection) and RP-HPLC(reversed- phase high -performance liquid chromatography with pre- column derivatization and UV detection)were compared. Theresults show that there is notable difference in determination of serine (Ser)， isoleucine (Ile) and proline (Pro) for samesample between the two metliods. Key words：Ganoderma sinense；Amino acid；Pre-column derivation；Post - column derivation 高效阳离子交换色谱-柱后衍生法(HPCEC)和柱前衍生-反相高效液相色谱法(RP-HPLC)是比较常用的氨基酸分析方法。了解这两种方法在氨基酸检测上存在的差异，有助于在实际工作中应根据不同的情况加以选择，提高检测的准确性。本研究采用这两种方法分析比较紫芝药材中氨基酸成分。 1 材料与方法 1.1 材料 样品1、2分别取自栽培示范基地和种植示范户，品种均为闽紫962。生药材经福建中医学院吴锦忠教授鉴定为紫芝正品 Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang。按照《中国药典》一部附录ⅡA药材 取样法，从批量待测药材取样 500g，切片后40目粉碎备用。 1.2 柱前衍生法(RP-HPLC) 1.2.1样品制备及前处理 分别取一定量样品精密精定，加入10ml 6N 盐酸于105℃隔氧水解 24h。赶酸，过滤后，取定量干燥(乙醇：水： TEA=2：2：1，20ml/min)、衍生(PITC：乙醇：TEA：水=1：7：1：1)，抽干衍生剂，进样前稀释定容。三乙胺(TEA)、异硫氰酸苯脂(PITC)为和光特级，其余试剂为国产色谱级或分析纯品。 1.2.2 分析仪器及工作条件 Waters M244 高效液相色谱仪， Pico - Tag 专用分析柱(Waters)及水解工作站，M990二极管车列检 ( 收稿时期：2006-06-19 ) ( 基金项目：福建省科技计划项目[2004S004]支助 ) ( 作者简介：陈丽艳(1973~)，女，主管中药师，从事药品检验和中药材质量监控工作。E - mail：hqrfjds@ sina. com ) 测器。色谱柱温度43℃；流动相A：0.1mM NaAc +0.5mlTEA，以 HAc 调pH=6.4，加乙腈 50ml；流动相B：60%乙腈水溶液；梯度控制3~46%，周期28，流速1.0ml/min；，检测波长254nm。17种氨基酸标准液(H型，2.5umol/ml)为进口分析纯(日本和光)。 1.3 柱后衍生法(HPCEC) 1.3.1 样品制备及前处理 分别取一定量样品精密密定，制羊照GB/T18246-2000进行。 1.3.2 分析仪器及工作条件 分析仪器为 HITCHI 835 -50型氨基酸自动分析仪，采用 72min 标准程序。2619*树脂(2.6mm×150mm，分离柱)，2650*树脂(4.0mm×50mm，去氨柱)；柱温53℃，缓冲泵流速为 0.225ml/min，压力0.025Kgf/cm²；茚三酮流量 0.225ml/min，(570nm/254nm)双波长检测，衰减幅度ATT=7、标准品及化学试剂为进口分析纯(日本和光)。 2 结果与分析 表1 紫芝子实体氨基酸分析结果比较*(mg/100mg，n=3) 氨基酸 柱前衍生法(RP-HPLC) 柱后衍生法(HPCEC) 样品1 样品2 样品1 样品2 天冬氨酸(Asp)0.713 0.692 0.705 0.762 苏氨酸(Thr) 0.254 0.246 0.416 0.369 丝氨酸(Ser) 1.395 1.373 0.387 0.361 谷氨酸(Glu) 0.589 0.573 0.854 0.758 脯氨酸(Pro) 0.250 0.242 0.146 0.157 甘氨酸(Gly) 0.287 0.283 0.397 0.331 丙氨酸(Ala) 0.344 0.343 0.464 0.401 胱氨酸(Cys) 0.016 0.015 0.088 0.085 缬氨酸(Val) 0.325 0.318 0.244 0.197 蛋氨酸(Met) 0.061 0.057 0.076 0.046 异亮氨酸(Ile) 0.248 0.234 1.261 1.173 亮氨酸(Leu) 0.355 0.344 0.568 0.640 酪氨酸(Tyr) 0.091 0.083 0.181 0.136 苯丙氨酸(Phe)0.344 0.343 0.354 0.310 赖氨酸(Lys) 0.189 0.183 0.391 0.302 组氨酸(His) 0.108 0.083 0.162 0.110 精氨酸(Arg) 0.333 0.311 0.231 0.229 2.1 两种方法均可同时检测17种氨基酸，各自检测结果基本吻合 分析结果表明，采用柱前衍生法和柱后衍生法 均可从紫芝中检出17种氨基酸，而且对样品1和2的各自检测结果基本吻合(表1)。前者测得的样品1和样品2全氨基酸含量为 5.902 mg/100mg 和5.733 mg/100mg，必需氨基酸构成比例相近(E/T=0.319和0.320)。而后者测得的样品1和样品2全氨基酸含量为6.925 mg/100mg 和6.376 mg/100mg，E/T接近(0.517和0.511)。 2.2 两种方法对某些氨基酸组分的检测值差异显著 柱前衍生法和柱后衍生法在测定同一样样时，除天冬氨酸(Asp)和苯丙氨酸(Phe)检测值相近外，多数组分的检测值均存在明显的差异，尤其在某些氨基酸组分上的差异显著。如前者对样品1和2中丝氨酸的检测值较低(0.387 mg/100mg，0.371 mg/100mg)，异亮氨酸较高(1.261 mg/100mg， 1. 173mg/100mg)；而后者检测结果正好相反，丝氨酸较高(1.395 mg/100mg 和1.373 mg/100mg)，异亮氨酸较低(0.248 mg/100mg 和0.234mg/100mg)。 另外，样品1和2的脯氨酸检测值也存在较大差异。柱前衍生法检测含量分别为0.250 mg/100mg 和0.242 mg/100mg，而柱后衍生法检测则分别为0.146 mg/100mg 和0.157 mg/100mg。由此可见，不同衍生剂(茚三酮与异硫氰酸苯脂).及紫外检测波长(440nm 与254nm)等对脯氨酸的测定值有较大的影响。 3 讨论 氨基酸自动分析仪采用高效阳离子交换色谱分离-柱后茚三酮衍生-分光光度法测定氨基酸，是一种已成熟的经典的氨基酸分析方法，但局限于(氨基酸)一类分析。近20年来，柱前衍生-反相高效液相色谱法分析氨基酸得到了迅速发展。选择适宜的衍生剂可以提高特定氨基酸成分的检测灵敏度和精度3，如如硫氰酸苯酯(PITC)衍生法测定茶叶中茶氨酸4。 PITC 柱前衍生反应速度快，一、二级氨基酸均可与异硫氰酸苯酯反应生成单一、稳定的苯氨基硫甲酰衍生物(PTC)，经 RP-HPLC 分离后紫外检测(254nm)；PITC 衍生法得到较为广泛的应用。 据报道(陈体强等，2001)闽紫96子实体中丝氨酸含量为0.361~0.358 mg/100mg，异亮氨酸含 量较高为1.173-1.449 mg/100mg2，与本次柱前衍生法的检测结果非常接近，表明氨基酸自动分析仪检测结果重现性高。氨基酸自动分析仪采用柱前衍生法-高效阳离子交换色谱法，其检测结果更可靠。因此，在建立中药材紫芝质量标准及其检测评价方面，建议采用氨基酸自动分析仪。 ( 参考文献 ) ( [1]于泓，牟世芬.氨基酸分析方法的研究进展[J].分析 ) ( 化学，2005，33(3)：398-400. ) ( [2]陈体强，李开本，林兴生等.紫芝的子实体、担孢子形态及其营养成分[J].江西农业大学学报，2001，23(3)： 325~328. ) ( [3]宋志峰，王丽，纪锋等.氨基酸分析中的柱前衍生技术[J].吉林农业科学，2004，29(6)：54-58. ) ( [4]郭升平.高效液相色谱法测定茶叶中茶氨酸的研究 [J].色谱，1996，14(6)：464-465. ) 敬 告 读者 为感谢作者和读者长期对本刊的支持，本刊在历年作者和全国分析测试工作者中优选部分作为赠阅对象，请在收到2007年赠阅样刊后，给予回音(请注明姓名、单位、地址、邮编)。方式可用回信、电话、传真、电子邮件等，以便准确投递。若无回音者，本刊今后将不再赠阅。 另外，本刊编辑部还有(1999年~2006年)部分过刊，欢迎各单位资料室/图书馆来信索取，免邮资。 就此告知! 本刊地址：福建省福州市北环中路61号 编：350003 电 话：0591-87830371 传 真：87816597 E -mail：fjtot@163.com 高效阳离子交换 色谱 一柱 后衍生法 (HPCEC)和柱前衍生 一反相高效液相色谱法 (RP—HPLC)是比较常用 的氨基酸分析方法… 。了解这两种方法在氨基酸检测上存在 的差异 ，有助 于在实际工作 中应根据不 同的情况 加 以选 择 ，提 高检测的准确性。本研究采用这两种 方法分析 比较紫芝药材 中氨基酸成分