蔬菜中盐酸甲哌检测方案(液相色谱仪)

吴泽明1， Charles T. Yang?， 江峥1， Wei Wei， 徐牛生1，郑传奇 1赛默飞世尔科技(中国)公司色谱质谱部，上海，中国 近些年来，此起彼伏的食品安全事件引起了人们强烈的关注，持续不断地严格加强食品安全监管已经成为全社会最大的共识，这直接刺激了限量标准更严格、体系架构更严谨完备的食品安全标准的诞生与升级。在中国，新版 GB2763-2014《食品中农药最大残留限量》国家标准已正式颁布实施，它连同日本的肯定列表制度(positive list system)、欧盟的 EU/EC 指令条例 No.752/2014 等一道，共同构成了各国严格的食品安全监管法规标准体系。相较于上一版，新国标2763-2014收录的农残种类与最大残留量指标(MRLs)都有了较大的扩容增项，这无疑对相应的农残检测手段提出了更高更严格的技术要求。时至今日，食品安全领域中的工作常态已然转变为对复杂基质中数百计的多农残项目同时进行高灵敏度、高特异性的高通量检测，这种业态转变需要质谱技术的革新，也需要测试解决方案的完善。 TSQ Endura LC-MS/MS 是基于主动离子管控技术( ActiveIon Management， AIMIM)开发的全新一代液质联用系统，它通过 S-lens 射频透镜组、中性粒子挡杆、HyperQuad 四极杆、主动离子碰撞童、双模式离散打拿极检测器等集成创新(图1)，使得仪器对离子聚焦、传输、隔离、碰撞与检测等离子操控环节得以实现了全新突破，赋予了其领先的灵敏度、高达500SRM/s 的扫描速度与出色的稳健性，从而能全面满足复杂基质中多农残高通量检测的各种技术挑战，在食品安全领域中具有广阔的应用空间与使用价值。 本文展示了一种以 TSQ Endura MS 为平台、以 TraceFinder TM软件为流程化驱动引擎的一站式农残检测解决方案，并将其用于菜椒基质中440种农残同时定量的高通量检测分析。 图1.创新的 TSQ Endura MS 质谱仪硬件构造示意图 2.实验条件 2.1样品制备 实验使用的农残标样由 Ultra Scientific 公司提供( RhodeIsland， USA)， 440 种农残混标乙腈溶液的母液浓度为2.5 pg/mL。 菜椒(bell pepper ) 空白基质由美国 California Departmentof Food and Agriculture 提供，基质由15g菜椒匀浆物使用15mL乙腈， 经QuEChERS 方法提取获得。配置基质加标样时，先取适量基质加入1.5倍体积超纯水用以改善溶剂效应。再取农残混标，使用乙腈/水(v/v，4/6)逐级稀释，最后将加水后的空白基质与对应浓度点的标样溶液混合，充分涡旋混匀后，得浓度为 0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5…~200 pg/uL (ppb)的一系列溶液。由低至高，每个浓度点重复进样三针，用以测试农残在菜椒基质中的最低检测限(LOD)与定量限(LOQ)，每个农药的标准曲线在 LOQ到200 pg/uL浓度区间内绘制。 反相色谱分离使用 Thermo Dionex Ultimate 3000 超高效液相色谱仪完成，配备 HPG3400-RS二元高压梯度泵(35pL 小体积静态混合器)、WPS-3000TRS 自动进样器与 TCC-3000RS柱温箱，色谱条件见下表。 色谱柱： Thermo Scientific Accucore aQ (100×2.1mm， 2.6 um) 水相： H，O+5mM 甲酸铵+0.1%甲酸 流动相： 有机相： MeOH+5mM 甲酸铵+0.1%甲酸 流速： 300 pL/min 柱温： 30℃ 时间/min 水相% 有机相% 0.0 98 2 0.5 98 2 梯度： 2.0 60 40 20.0 5 95 22.0 5 95 22.1 98 2 25.0 98 2 2.3质谱检测 质谱检测使用TSQ Endura MS 串联三重四杆杆质谱仪的 tSRM定时选择反应监测功能 ( timed Selected ReactionMonitor )进行，配备 Easy-Max NG'M HESI加热电喷雾离子源。包括保留时间、SRM 离子对、RF电压与碰撞能量等在内的tSRM条件，直接从TraceFinder 软件pQuan化学数据库( version1.0， pesticides Quantitation chemical database)调用(图2)，TSQ Endura MS 仪器方法编辑为拖拽-释放式设计，且支持各种方法模板的灵活定制(图3)。根据农残不同的电离属性，方法中正负电离模式来回切换。依据不同化学属性的农药因色谱行为而造成的峰宽不同，设定 tSRM 时间窗口为1~5 min。除十三吗啉、丙环唑等少数物质外，其余绝大多数设定为1min。 Q1与Q3分辨率设定为0.7 FWHM， Q2碰撞池氩气压力为 1.5 mTorr。tSRM 扫描循环时间( cycle time ) 为 1.2 s.其余质谱条件见下表。 气化温度 vaporizer temp.： 450℃ 离子传输管温度 ion transfer tube temp.： 200℃ 喷雾电压 spray voltage： 3500 V(ESI+)， 2500V (ESI-) 革气流速 sheath gas： 60 arb 辅助气流速 Aux gas： 5 arb 吹扫挡锥气流速 sweep gas： 1 arb 图2农残检测方法 TraceFinder pQuan 化学数据库 图3实验使用的质谱 tSRM 仪器方法模板界面 2.4数据处理 实验使用 TraceFinder 3.2软件进行数据库管理、序列采集、数据处理以及报告模板自定义与输出，其灵活强大的功能可为农残检测的流程化提供一站式服务。尤其，作为面向食品安全常见农残的检测方法数据库， TraceFinder 中 pQuan 数据库包含了完备的农残定量与确证信息，以及保留时间、CAS、基本用途等其他相关信息(图2)。利用 pQuan 数据库，实验无需再使用标样进行繁琐的方法优化与开发，而是从数据库中调取相关的条件，直接进行样品测定。如图4展示的步骤，TraceFinder 软件使得同时进行数百种农残检测的繁复工作大大清晰地流程化了。 及报告输出 图4 TraceFinder 软件用于农残检测的流程化工作步骤 3.结果与讨论 TSQ Endura MS 具有业界领先的 SRM 扫描速度，使用简便的 tSRM功能，质谱只在给定的时间窗口内进行特定离子对的扫描。一方面，这大大提高了质谱扫描离子驻留时间(dwelltime)的利用率；另一方面，也唯有此才使得在短至20 min的快速梯度内同时对数百余种农残进行高灵敏度检测成为可能(图5)。通过对色谱条件的系统尤化，从图6散点图与频次图可知，实验实现了对440种农残良好的色谱分离，它们均匀地分布在20 min 有效分离时间窗口内，这确保了质谱 tSRM扫描循环时间可以较为均衡地分配到每个 transition上，改善定量效果。 图5上图：菜椒基质中440 种农残同时检测的总离子流图， "下图：440种农残的提取离子色谱图(10pg/pL) 图6(1)农残精确 m/z vs.保留时间散点图，，((2)保留时间的频次分布图 TraceFinder 具有丰富强大的数据浏览、编辑与再处理等功能，能为高通量农残检测数据处理提供全方位的功能支持。图7为TraceFinder 数据结果的一种典型界面，这中间 LC-MS/MS 农残分析的各种信息得以高度凝练地图形化展示，统全局于一眼，大大有助于提高实际检测工作中的信息处理效率。同时，这一界面可模板化编辑，具有出色的可扩展性，能满足不同实验室的个性化需求。 图7 TraceFinder农残检测数据处理结果的典型界面( Compound View) 实验严格综合考虑峰面积的变异系数CV%((LOD 浓度点处三次重复进样的 CV%开始稳定重现地小于30%， LOQ浓度点处小于20%)、色谱峰形与信噪比等三种因素，确定了 TSQ Endura MS 对菜椒基质中440种农残进行同时检测的 LOD 与 LOQ 值，结果见表1。根据农药化学属性导致的响应水平不同， LOD 在 0.005 pg/pL ( 5 ppt) 到 20 pg/pL ( 20 ppb) 之间， LOQ分布在0.01pg/pL(10 ppt) 到50 pg/pL(50 ppb)范围内，对应的峰面积CV%分别为 0.34~29.95%与0.43~19.94%。并且，有430种农残的标准曲线相关系数大于0.99， 显示 TSQ Endura MS 具有出色的线性。 表1菜椒基质中440种农药的定量结果 农药名称 LOD(ppb) LOQ(ppb) RT(min) Parent-> Product m/z Polarity Confirm/ CE R² SRM transitionst 硫丙磷 0.05 0.10 16.17 323.090->155.061，323.090->139.117 + 33 0.9989 快螨特t 0.05 0.10 16.21 368.140->107.198，368.140->57.440 + 23 0.9985 虫螨磷 0.10 0.50 16.29 361.020->304.902，361.020->224.955 25 0.9910 甲氨基阿维菌素B1a 苯甲酸盐 0.20 1.00 16.40 886.505->158.190， 886.505->82.301 + 47 0.9985 氟虫脲 0.05 0.10 16.50 489.040->158.090， 489.040->141.090 + 43 0.9992 酞酸二环己基酯 0.01 0.02 16.57 331.090->149.094， 331.090->121.166 + 47 0.9992 甲氰菊酯 0.05 0.10 16.57 350.180->125.172，350.180->55.436 47 0.9993 仲丁灵 0.02 0.05 16.58 296.185->240.110，296.185->222.110 + 24 0.9997 除虫菊素1 1.00 2.00 16.73 329.160->105.250， 329.160->128.180 + 34 0.9988 氯硫磷十 0.20 0.50 16.80 315.000->214.985， 315.000->186.996 + 35 0.9991 螺螨酯 0.02 0.05 16.81 411.085->313.027，411.085->71.376 + 18 0.9995 丙硫特普 0.01 0.02 16.81 379.115->210.890，379.115->115.073 + 33 0.9996 丁醚脲 5.00 10.00 16.89 385.255->329.184， 385.255->278.176 + 35 0.9965 唑螨酯 0.01 0.02 16.89 422.235->366.126，422.235->214.136 + 32 0.9990 氯氰菊酯 0.50 1.00 17.00 433.085->191.064， 433.085->199.160 + 15 0.9990 异丙乐灵 0.50 1.00 17.18 310.230->222.093， 310.230->264.158 + 20 0.9995 氟啶脲 0.10 0.20 17.30 539.995->382.974， 539.995->346.999 46 0.9993 苯醚氰菊酯 2.00 5.00 17.37 376.240->181.081，376.240->153.105 + 47 0.9988 脱叶磷 0.01 0.01 17.43 315.150->169.018，315.150->57.423 + 25 0.9997 苄呋菊酯1 0.05 0.10 17.79 339.250->171.147，339.250->143.173 + 27 0.9994 克来范 5.00 20.00 17.86 632.675->426.652，632.675->586.693 一 18 0.9905 喹螨醚 0.01 0.02 17.93 307.230->161.188，307.230->57.448 + 25 0.9995 苄呋菊酯2 0.02 0.05 18.01 339.150->171.124，339.150->143.182 + 27 0.9997 氟胺氰菊酯 0.05 0.10 18.04 503.155->208.075， 503.155->181.100 + 25 0.9990 醚菊酯十 0.05 0.10 18.39 394.240->359.174，394.240->135.156 + 26 0.9996 ：母离子为[M+NH4]*峰，其余均为[M+H]*或[M-H]峰。 1：前一个子离子为定量离子，后一个为定性确证子离子1。 进一步的统计分析得知，实验中440种农残 LOD 与 LOQ的中位数值( median value)分别为 0.05 pg/pL (50 ppt) 与0.1 pg/pL (100 ppt)，显示了基于主动离子管控技术研发的TSQ Endura MS 具有出色的灵敏度性能。同时，值得注意的是，本实验为确保分析的高通量性与大多数农农的检测效果，使用了单一流动相体系进行快速正负电离切换，一定程度上牺牲了适用于负离子模式的农残的检测灵敏度(使用乙酸铵体系，会有很大改善)。但尽管如此，如图8所示，对表1中的农残LOD 与 LOQ值进行频次分析可知，累计分别有438(占总数的99.5%)与430种(占总数的97.7%)农残的 LOD 与 LOQ小于10 pg/pL这一国标最低MRL 限值，同时这也是欧盟法规与日本肯定列表制度中的通用标准。本方法实现的 LOQ全部满足 GB2763-2014 强制国家标准中的 MRLs 指标要求。因此，TSQ Endura LC-MS/MS 是食品安全领域中高灵敏度、高特异性与高通量农残检测的优质平台。 ( 。利用主动离子管控技术的创新设计， TSQ Endura MS 实现了出色灵敏度、极致耐用性与高度易用性的有机统一。 ) · TraceFinder 强大灵活的数据处理功能、智能交互式信息管理界面，以及pQuan 农残检测方法数据库，能够为农残检测提供一站式的全流程服务。 · TSQ Endura LC-MS/MS 与 TraceFinder 软件强强联合，将在农残检测中具有广阔的应用空间。 图8本实验中440种农残同时检测的LOD 与 LOQ值频次统计结果 。作者们对赛默飞世尔科技美国圣何塞工厂的 Dr. Jia Wang 与Dr. Dipankar Ghosh 表示最诚挚的感谢，感谢他们在标样采购与实验组织过程中提供的无私帮助。感谢 CDFA 馈赠给我们多种蔬菜与水果空白基质。 SCIENTIFIC Thermo FisherSCIENTIFIC赛默飞世尔科技(中国)有限公司免费服务热线： 支持手机用户)客服邮箱： sales.china@thermofisher.com 近些年来，此起彼伏的食品安全事件引起了人们强烈的关注，持续不断地严格加强食品安全监管已经成为全社会最大的共识，这直接刺激了限量标准更严格、体系架构更严谨完备的食品安全标准的诞生与升级。在中国，新版GB2763-2014《食品中农药最大残留限量》国家标准已正式颁布实施，它连同日本的肯定列表制度（positive list system）、欧盟的EU/EC指令条例No.752/2014等一道，共同构成了各国严格的食品安全监管法规标准体系。相较于上一版，新国标2763-2014收录的农残种类与最大残留量指标（MRLs）都有了较大的扩容增项，这无疑对相应的农残检测手段提出了更高更严格的技术要求。时至今日，食品安全领域中的工作常态已然转变为对复杂基质中数百计的多农残项目同时进行高灵敏度、高特异性的高通量检测，这种业态转变需要质谱技术的革新，也需要测试解决方案的完善。TSQ Endura LC-MS/MS是基于主动离子管控技术（Active Ion Management，AIMTM）开发的全新一代液质联用系统，它通过S-lens射频透镜组、中性粒子挡杆、HyperQuad四极杆、主动离子碰撞池、双模式离散打拿极检测器等集成创新（图1），使得仪器对离子聚焦、传输、隔离、碰撞与检测等离子操控环节得以实现了全新突破，赋予了其领先的灵敏度、高达500 SRM/s的扫描速度与出色的稳健性，从而能全面满足复杂基质中多农残高通量检测的各种技术挑战，在食品安全领域中具有广阔的应用空间与使用价值。本文展示了一种以TSQ Endura MS为平台、以TraceFinder™软件为流程化驱动引擎的一站式农残检测解决方案，并将其用于菜椒基质中440种农残同时定量的高通量检测分析。