治疗性蛋白质中杂质或异型体检测方案(液相色谱仪)

作者 Srividya Kailasam、Jochen Strassner Faizy Ahmed 和 Martin Vollmer 安捷伦科技有限公司 印度班加罗尔和 德国瓦尔德布隆 P.M. Sundaram， Bharathi SriramGangagen 生物技术有限公司，印度班加罗尔 采用 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统通过肽谱分析、SEC 和IEX对治疗性蛋白质进行理化表征 应用简报 生物制药 摘要 本文利用新型 Agilent 1260 生物惰性四元液相色谱系统开发了用于表征治疗性蛋白质P128的高灵敏快速液相色谱方法。其中采用亚 2 pm 色谱柱技术得到最优肽图，缩短了这种蛋白的分析时间。利用新型安捷伦生物惰性高效液相色谱柱进行体积排阻色谱 (SEC)及离子交换色谱(IEX)分析，以检测蛋白制剂中可能存在的杂质或异型体。具有生物惰性和耐腐蚀性的仪器与简单且重现性良好的方法相结合，使得该解决方案适用于 QA/QC 实验室的常规应用。 前言 在药物开发的每个阶段均需深入分析治疗性蛋白的理化性质，以确保药物的安全性及有效性。通常采用一些基于液相色谱的试验对蛋白药物进行鉴定并确定其完整性，例如肽图分析， SEC 及 IEX。 P128是一种抗葡萄球菌蛋白，名义分子量为28 kDa。 大在大肠杆菌中重组表达。本应用简报证实了 Agilent 1260生物惰性四元液相系统通过反相色谱法适用于分析胰酶消化 P128所得的肽段，并且可结合新型生物液相色谱柱及 IEX和SEC 法用于鉴定结构异构体。 实验部分 完全生物惰性且生物兼容、最高耐压达600 bar 的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统由以下几个模块组成： · Agilent 1260 生物惰性四元液相色谱泵 (G5611A) ( · Agilent 1260 生物惰性高性能自动进羊 器(G5667A) ) ·Agilent 1200 系列柱温箱 (G1330B) ·包含生物惰性加热元件的 Agilent 1260 柱温箱 (G1316C选项19) ·配有60mm 最大光强高灵敏度流通池的 Agilent 1260 DAD (G4212B 选项33) ·软件： ChemStation B.04.02 在整个样品流路中没有任何金属组件，因此样品不会接触到金属表面。溶剂输送管路中没有任何不锈钢或铁铁组件。 化学品与试剂 P128 由 Gangagen 生物技术有限公司提供，三羟甲基氨基甲烷、尿素、二硫苏糖醇 (DTT) 及碘乙酰胺均购自 Sigma Aldrich公司，三氟乙酸、磷酸氢二钠、磷酸氢钠和氯化钠均购自 Fluka 公司。乙腈(LiChrosolv)及Millipore 水用于配制流动相。 样品前处理 蛋白在含有尿素的条件下用 DTT 进行还原，然后采用碘乙酰胺进行烷基化。样品稀释并超滤后， 在 tris 缓冲液(pH7.6)中消化过夜。酶解时，酶与底物的比例保持为1：20。通过加入1 uL的10%甲酸溶液淬灭酶活性。样品用真空浓缩干燥，然后采用100 pL 的 0.25 M tris 缓冲液 (pH 7.6)进行复溶。 230 nm/4 nm， 参比： 400/60 nm (也在214nm、240 nm、260 nm和280nm 波长下采集数据) 体积排阻色谱 色谱柱 色谱柱1： Agilent Bio-SEC-3色谱柱， 3pm， 300A， 7.8 mmx300 mm (部件号5190-2511) 色谱柱2： Agilent Bio-SEC-5色谱柱， 5 pm， 300 A， 7.8 mm×300 mm (部件号5190-2526) 色谱柱3： 品牌ASEC-5色谱柱， 5pm， 300 A， 7.8 mm x300 mm 液相色谱方法 进样量： 1pL 流动相A： 含有150mM氯化钠的150mM磷酸钠(pH=7.0) 流速： 1mL/min UV检测器： 220nm/4nm参比：关闭(同时也采集230nm 和280 nm 波长下的数据) 离子交换色谱 样品经超滤脱盐，萃取至20mM 磷酸钠 (pH=6) 中。 色谱柱 色谱柱1： Agilent Bio MAb NP 5 色谱柱， PK， 4.6 × 250 mm， 5 pm (部件号5190-2407) 色谱柱2： Agilent Bio MAb NP 10 色谱柱， PK， 4.6 ×250 mm， 10pm(部件号5190-2415) 色谱柱3： 品牌B WCX-10色谱柱， 4.0 mm×250mm， 10 pm 液相色谱方法 进样量： 2pl 流动相A： 20mM磷酸钠(pH=6.0) 流动相B： 含1.0M氯化钠的20mM磷酸钠(pH=6.0) 流速： 0.5 mL/min 分钟 035 3536 10 45 10 UV检测器： 220 nm/4 nm， 参比：关闭 (同时也采集220nm、230 nm、240 nm 和280 nm 波长下的数据) 结果和讨论 肽图分析 通常采用肽图分析确证蛋白种类。首先通过蛋白酶消化治疗性蛋白质，然后采用高分离度反相 HPLC进行分析，从而获得肽图。分析的目标是色谱分离并检测所有蛋白片段，以实现完整序列覆盖。由于被分析样品很复杂，其中含有数百种不同的化合物，因此肽图分析需要很长的分析时间。在药物开发的早期，选用质谱作为鉴定所有肽段碎片的检测技术。而在后期和QA/QC过程中，确证肽段谱图最常使用UV 检测。生物惰性仪器对疏水性的肽段及蛋白尤其具有优势，由于这些成分常常粘附在金属表面。 在本研究中，我们展示了一个26 kDa 的重组表达新型生物制剂 (NBE)的数据，这是 Gangagen 技物技术公司正在开发的一种用于治疗人类疾病的抗菌素蛋白 P128。结合 Agilent Bio HPLC 色谱柱以及开发用于生物大分子分析的 Agilent 1260 Inifinity生物惰性四元液相色谱仪器，可对这种蛋白进行肽图分析、SEC 及离子交换色谱分析。 基于 UV的肽图分析常用于 QA/QC NBE环境以检测重组蛋白药物在生产或加工过程中发生的所有序列异常。 图1展示了采用 Agilent 1260 Inifinity 生物惰性四元液相色谱系统获得的肽图，其中应用了两种反相色谱柱： ·Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱，3.0×100mm， 1.8 um ·AdvanceBio 肽图分析色谱柱，3.0×150 mm， 2.7 pm 在该示例中， Agilent Eclipse Plus 色谱柱所得的分离度略好。因此，采用该色谱柱作进一步研究。 A) Agilent ORBAX Eclipse Plus C18色谱柱， 3.0mmx100mm， 1.8 pm， B) AdvanceBio 肽图分析色谱柱， 3.0 mmx150 mm， 2.7 um 分析非常复杂的混合物时需要尽可能高的分离度，因此通常导致分析时间过长，例如肽图分析。亚2 pm (STM)填料技术与UHPLC仪器相结合，可显著缩短分析时间，同时保持高分离度(图2a-2d)。 mAU _ 0.2 mL/min 500 A 图 2a-2d.利用 Agilent ORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱(3.0 mmx100 mm， 1.8pum)，在不同梯度和流速下进行 P128酶解物的分析 分析的稳定性和重现性是表征治疗药物以验证所选 NBE 的特性和完整性的最重要因素，同时也是满足监管部门需求的最重要因素。我们利用 Agilent 1260 Inifinity 生物惰性四元液相色谱仪在 Agilent ZORBAXEclipse Plus C18色谱柱(3.0×100mm，1.8pm)上进行了五次重复进样分析。(图3显示了五次分析后保留时间和峰面积的重现性极好)。 检测微量杂质时需要高灵敏度的分析。采用最大光强流通池技术的 Agilent 1260Inifinity DAD 的灵敏度比采用旧版流通池设计的 Agilent 1260 Inifinity DAD VL Plus 高出十倍(图4)。该技术可检测修饰，例如克隆表达发生变异所产生的修饰。它还可降低珍贵样品的消耗。据观察发现，配备.60mm最大光强流通池的 Agilent 1260Inifinity DAD (G4212B)的灵敏度是 Agilent1260 Inifinity DAD VL Plus 检测器 (G1315C)的十倍。 图 3.采用 Agilent ORBAX Eclipse Plus C18色谱柱 (3.0 mm×100 mm，1.8 pm) 在0.6 mL/min 流速下以相应梯度进行五次 P128酶解物分析的叠加图 图4.应用配备 A) Agilent 1260 Infinity DAD， 60 mm 最大光强流通池或 B) Agilent1260 Inifinity DAD VL Plus (G1315C) 的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性高效液相色谱系统，采用Agilent ORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱， 3.0mmx100 mm， 1.8 pm 在0.6 mL/min流速下以相应梯度分别进行P128酶解物分析的色谱图叠加 体积排阻色谱 为了证实蛋白的完整性或证明天然构象中未形成二聚体或多聚体，体积排阻色谱(SEC) 结合 UV检测是一种常用的分析技术。体积排阻的缺点是分离度较低。采用小粒径 SEC 色谱柱可得到出众的分离度并可最大限度地减少次级相互作用，因此是检测杂质或多聚体形成的有力工具。采用肽图分析中的相同蛋白进行 SEC 实验。其中比较了两种5-pm粒径色谱柱和一种3-um径径色谱柱的结果。混合物中的第二种化合物只在使用 Agilent Bio-SEC 3-pm色谱柱的条件下才可被检测(图5)。 图 5.应用 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统以及不同的 SEC 色谱柱进行P128治疗性蛋白样品的体积排阻分析 离子交换色谱可用于分离生产或加工过程中末端赖氨酸残基发生氧化、脱酰胺化或截断所产生的 NBE 电荷异构体。为了从主峰中分离碱性或酸性异构体，分离度必须高且次级表面相互作用需要尽可能小。采用Agilent 1260 Infinity 生物惰性及防腐蚀的四元液相系统并使用 Agilent Bio Mab 5及 Bio Mab 10 色谱柱及一种尺寸相似的商用色谱柱(品牌B) 对P128蛋白脱盐样品进行分离。应用 Agilent Bio Mab 5色谱柱可获得最佳峰形及最高效率(图6)。 结论 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相系统及 Agilent Bio 高效液相色谱柱系列为表征治疗性蛋白药物 P128的理化性质提供了一个强大的多功能工具。用于分析治疗性蛋白的安捷伦解决方案可实现生物惰性、卓越的分离度、抗腐蚀性、高灵敏度及快速的分离。 图 6.应用 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统以及不同的阳离子交换色谱柱进行 P128治疗性蛋白样品分析所得的弱阳离子交换色谱图 www.agilent.com/chem/bio-inert C安捷伦科技(中国)有限公司， 20132013年12月1日出版号5990-6192CHCN Agilent Technologies 摘要本文利用新型Agilent 1260 生物惰性四元液相色谱系统开发了用于表征治疗性蛋白质 P128 的高灵敏快速液相色谱方法。其中采用亚2 μm 色谱柱技术得到最优肽图，缩短了这种蛋白的分析时间。利用新型安捷伦生物惰性高效液相色谱柱进行体积排阻色谱(SEC) 及离子交换色谱(IEX) 分析，以检测蛋白制剂中可能存在的杂质或异型体。具有生物惰性和耐腐蚀性的仪器与简单且重现性良好的方法相结合，使得该解决方案适用于QA/QC 实验室的常规应用。前言在药物开发的每个阶段均需深入分析治疗性蛋白的理化性质，以确保药物的安全性及有效性。通常采用一些基于液相色谱的试验对蛋白药物进行鉴定并确定其完整性，例如肽图分析，SEC 及IEX。P128 是一种抗葡萄球菌蛋白，名义分子量为 28 kDa。它在大肠杆菌中重组表达。本应用简报证实了Agilent 1260 生物惰性四元液相系统通过反相色谱法适用于分析胰酶消化P128 所得的肽段，并且可结合新型生物液相色谱柱及IEX 和SEC 法用于鉴定结构异构体。结论Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相系统及Agilent Bio 高效液相色谱柱系列为表征治疗性蛋白药物P128 的理化性质提供了一个强大的多功能工具。用于分析治疗性蛋白的安捷伦解决方案可实现生物惰性、卓越的分离度、抗腐蚀性、高灵敏度及快速的分离。