镇痛药和非甾体类抗炎药中快速筛选检测方案(液相色谱仪)

采用 HPLC 快速筛选痛痛药和非甾体类抗炎药的方法 应用简报 小分子药物与仿制药 作者 前言 William Long 安捷伦科技公司 最早记载的治疗疼痛的一些方法包括使用镇痛药。希波格拉底首次报告了采用柳树皮[1]减轻炎症。1763年4月25日， Edward Stone 向皇家学会致信论述了他针对使用柳树皮药物治疗发烧病人的观察结果。1827年， Johann Andreas Buchner 首次分离出了柳树皮的活性成份。1829年，法国化学家 Henri Leroux 改进了提取工艺，1897年，德国化学家 Felix Hoffmann 将水杨酸转化为乙酰水杨酸，命名为阿司匹林，从而开启了药理学的新纪元。其它非甾体类抗炎药 (NSAID) 从 20世纪50年代开始得到发展 [2]. NSAID 是一类具有解热镇痛作用的药物，并且较大剂量时具有抗炎作用。作为镇痛药，NSAID 的独特之处在于不具有催眠作用，因此，它们被用作麻醉剂的非成瘾性替代品 [3]. 阿司匹林、布洛芬和萘普生是这类药物中最为突出的代表，在大多数国家被作为非处方药使用[4]。对乙酰氨基酚和非那西丁几乎不具有抗炎作用，因此不能视为 NSAID。 利用选择性改善镇痛药的分离 关于提高色谱分离度的最佳途径，可参考分离方程，它涉及了柱效、选择性和保留特性(公式1)。 公式1 要获得高分离度，这三个参数必需最大化。增加柱长能够增加理论塔板数N，但可导致保留时间延长和谱带展宽，这种途径并不可取。相反，通过减小固定相颗粒的尺寸等同于降低理论塔板的高度。表面多孔颗粒填充柱(例如 Agilent Poroshell 120) 的柱效可达1.8 pm 柱的90%，而且背压相当低。 选择性因子a也可用于改善分离。选择性变量的变化可对所有分离产生最大程度的影响。选择性可通过改变流动相组成或固定相组分来增加。 因此，选择性是优化 HPLC分离的最强有力手段。该参数可通过使用诸如C18、极性嵌入基团、苯基和全氟苯基等不同的键合相或改变流动相来改变。在本应用简报中，采用4.6×50mm， 2.7 pmPoroshell 120 色谱柱快速评估用于类固醇分析的方法开发选择。这些色谱柱柱长短，柱效高，使得分析时间短并且平衡迅速，从而可快速研究方法的选择性。 ( 使用 Agilent 1260 Infinity 二元液相色谱，其包括： ) G1312B 二元泵SL， 可承受压力高达600 bar G1316C 柱温箱(TCC) G1376D SL Plus 型高性能自动进样器 G4212A 二极管阵列检测器，配有 G4212-60008型光程10mm， 容量1pL的流通池 所用色谱柱为： ( . Agilent Poroshell 120 PFP 色谱柱， 4 .6×50mm， 2.7 pm (部件号699975-408) ) ( Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱 ， 4.6×50mm， 2.7 pm (部件号699975-902) ) ( Agilent Poroshe l l 120 Bonus-RP色谱柱，4.6×50 mm， 2.7 pm (部件号699968-901) ) ( Agilent Poroshell 120 苯基己基色谱柱，4.6×50mm， 2 . 7 pm (部件号699975-912) ) 使用普通梯度分离评估色谱柱，该梯度由含甲酸铵 (20mMNH HCO，， pH 3.0)的甲醇或乙腈溶液组成。采用安捷伦化学工作站 C.1.05版控制仪器和处理数据。 ( 所测定的化合物包括对乙酰氨基酚、非那西丁、吡罗昔康、托美 汀、酮基布洛芬、萘普生、舒林酸、双氯芬酸和二氟尼柳，均购自Sigma-Aldrich 公司。所有镇痛药均具有包括氟(舒林酸和二氟 尼柳)和氯(双氯芬酸)在内的多种官能团。这些化合物的结构 和详细信息如图1和表1所示。所有样品用乙腈配制为10 mg/mL 的溶液并用水稀释，使得最终浓度为0.1 mg/mL 。 甲酸铵及甲 酸也购自 Sigma-Aldrich 公司 。 甲醇和乙腈乙自 Honeywell (Burdick and Jackson)。在本次分析中，所用的水经过 MilliQ水 纯化系统(Millipore) 0.2 pm滤膜过滤(电阻率为18 MQcm)。 ) 图1.镇痛药的结构 表1.镇痛药的保留时间、log P 和pKa 值 保留时间 保留时间 保留时间 保留时间 保留时间 保留时间 保留时间 保留时间 PFP柱 PFP柱 C18柱 C18柱 BrP柱 BrP主 PH柱 PH柱 化合物 log P pKa 乙腈 甲醇 乙腈 甲醇 乙腈 甲醇 乙腈 甲醇 对乙氨基酚 0.46 9.38 0.863 1.252 0.803 1.123 0.99 1.235 0.781 1.039 非那西丁 1.58 1.966 2.912 2.147 2.943 2.176 2.774 2.059 2.959 吡罗昔康 3.06 2.536 3.876 2.849 3.688 2.744 3.415 2.732 4.027 托美汀 2.79 2.868 4.137 2.928 4.265 3.173 4.073 2.893 4.395 酮洛芬 3.12 4.45 3.008 4.258 3.109 4.308 3.342 4.146 3.137 4.468 萘普生 3.18 4.15 3.112 4.505 3.249 4.436 3.342 4.218 3.167 4.468 舒林酸 3.42 4.7 2.934 4.656 3.249 4.308 3.173 4.288 2.995 4.594 双氯芬酸 4.51 4.15 3.53 4.795 3.9 5.046 4.043 4.87 3.711 5.106 二氟尼柳 4.41 2.69 3.659 5.094 3.249 4.567 3.867 4.919 3.091 4.559 选择色谱柱以提高选择性 选择色谱柱以提高分离选择性。这类色谱柱包括 Poroshell 120EC-C18柱，它是一种高度封端的C18柱，推荐作为方法开发的首选色谱柱。 Poroshell 120 Bonus-RP 色谱柱可用于进行与 C18柱相同的多种分离，同时还可避免C18 柱的某些缺点，比如含水量很高的流动相润湿性较差。此外，它对那些易受疏水作用以及酰胺基团的氢键作用干扰的分子具有更强的保留性。与烷基固定相比较，Bonus-RP色谱柱对酚类、有机酸和其沐极性溶剂具有更强的保 留性和选择性，这是由于诸如酸类和酚类的极性基团(氢键接受者)和氢键提供者之间较强的氢键作用所致。对两种色谱柱进行简单比较，无需改变流动相条件，结果发现 Bonus-RP色谱柱较C18柱的保留时间稍稍。Bonus-RP 固定相对极性化合物的选择性与C18柱不同。该色谱柱也适用于100%水的流动相。 Poroshell 120 苯基-柱基色谱柱对含芳香基团的化合物具有独特的选择性，可为这类样品提供卓越的分离。Poroshell 120 苯基-己基色谱柱还能够为中等极性化合物提供良好的分离，而典型的烷基固定相(C18和C8)色谱柱则无法为其提供足够分离度。乙 腈可以削弱芳香族和可极化分析物与苯基-己基固定相之间的拍-相互作用，而甲醇却增强此作用，使此两类分析物的保留增强并改变其选择性。这并不意味着乙腈不适用于苯基键合相或无法提供可接受的分离，但甲醇更可能提供苯基固定相所需的不同的选择性。 Poroshell 120 PFP 色谱柱具有五氟苯基配体。这种色谱柱可提供与传统反相柱正交的的离。 PFP固定相色谱柱利用特异性靶向多种极性保留机制，根据结构、取代基和极性基团空间位阻的微小差异分离分析物。它对位置异构体、卤代物和极性分析物的选择性使其特别适用于分析复杂混合物和小分子药物。 如图2所示，我们尝试了使用所有色谱柱对9种化合物进行分离。Poroshell 120 PFP 和 Poroshell 120 Bonus-RP色谱柱在大大5 min内按相同的顺序完全分离了所有化合物，以甲醇作为有机改性剂。与 Poroshell 120 Bonus-RP 色谱柱相比， PFP 色谱柱使所有峰的间隔更加均匀。Poroshell 120 苯基-己基色谱柱未与Poroshell 120 PFP 色谱柱生成相同的洗脱顺序。这意味着 PFP色谱柱不单单是较强的苯基柱；除n-n和疏水作用以外它还存在有其它的交互机理。4根色谱柱均先洗脱了对乙酰氨基酚 (APAP)和非那西丁。Poroshell 120 EC-C18 柱未能将三种化合物(托美汀、酮基布洛芬和舒林酸)完全分离。 图 2.使用 Agilent Poroshell 120 色谱柱所得的镇痛药的分离色谱图，以甲醇为有机相。A) 20 mM NH HCO，， pH 3.0；B)甲醇，40°℃，配有脉冲阻尼器和标准混合柱的 Agilent 1260 Infinity 二元液相色谱仪 图3显示了使用乙腈时4种色谱柱的分离结果。在这种情况下，只有 Poroshell 120 PFP 柱分离了所有化合物。Poroshell 120EC-C18 柱和 Poroshell 苯基-己基柱以相同的顺序洗脱了所有化合物。在通常情况下，使用乙腈使苯基-己基柱的n-儿键合作用几乎不存在。 PFP 和 Bonus-RP柱也具有相似的洗脱顺序(最后两个峰除外)。 由于 Poroshell 120 PFP 固定相色谱柱在使用甲醇或乙腈时，几乎可以分离所有9种化合物，这是对方法开发进行进一步研究的最佳选择。 表1列出了使用甲醇和乙腈时9种分析物在4种色谱柱上的保留时间。此外，还显示了 Log P 和 pKa值。Log P表示单个物质在一个界面分离的两种溶剂相之间的平衡分布情况。 图 3.使用 Agilent Poroshell 120 色谱柱所得的镇痛药的分离色谱图，以乙腈为有机相 研究发现多种单一有机溶质的麻醉作用可利用其油水分配系数得到更真实的反应。油相随后被辛醇所代替[5]。如图4中所示，log P 值与使用甲醇或乙腈时在 Poroshell 120 EC-C18柱上所得的保留时间相对应。图5显示了后7种镇痛药在使用甲醇和乙腈的Poroshell EC-C18 柱和 PFP柱上的保留时间数据的相关性。首先被洗脱的对乙酰氨基酚和非那西丁在所有溶剂-色谱柱组合中的洗脱顺序相同。除了这两种化合物，在甲醇(图5a)和在乙腈(图5b)中EC-C18柱与 PFP柱之间保留的相关性较差，并显示了明显的正交性。 图4.使用 Agilent Poroshell 120 EC-C18 柱的保留时间与 log P值的相关性 以甲醇为有机相， Agilent Poroshell 120 PFP柱与 EC-C18柱的比较 图5.以甲醇(5a)和乙腈(5b)为流动相时， Agilent Poroshell 120EC-C18柱的保留时间与 Agilent Poroshell 120 PFP柱的保留时间的相关性 通过引入方法开发方案中一般梯度的测量方法可以快速解决分析问题。本应用简报以镇痛药为例，揭示了如何开发具有不同选择性的固定相和使用诸如乙腈和甲醇等有机改性剂，以用于优化分离。在本示例中，发现广泛适用的 C18 固定相如 Agilent Poroshell120 EC-C18 柱却无法提供充分的分离。采用另一种选择性色谱柱如 Agilent Poroshell 120 PFP 柱可获得吉好的结果。由于氟化固定相可以增强与卤素以及共轭化合物的相互作用，因此非常实用。 ( 参考文献 ) ( 1 . N.G. Bisset. Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals， p.534. M edpharm Scientific Publishers， S t uttgart，Germany (2004). ) ( 2. G. Guerriero. Ann. N Y Acad. Sci. 1163， 154 ( 2 009). ) ( 3. P. Mackowiak. Clin. Ther. Dis.31， 154 (2000). ) ( 4. A. Streitweiser， K. Heathcock. Introduction to OrganicChemistry. MacMillan， N Y， USA (1981). ) 5.http：//en.wikipedia.org/wiki/Non-steroidal_anti-inflammatory_drug. ( 6. J. Sangster. Logkow： a database of evaluated octanol/water partition coefficients (Log P). Sangster Research Laboratories， Montreal， Canada. http：//logkow.cisti.nrc.ca/logkow/index.jsp. ) 更多信息 这些数据代表典型结果。有关我们的产品与服务的详细信息，请访问我们的网站 www.agilent.com/chem/cn www.agilent.com/chem/cn 安捷伦不对本文可能存在的错误或由于提供、展示或使用本文所造成的间接损失承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 @安捷伦科技(中国)有限公司，2014 2014年4月4日，中国印刷 5991-4291CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies 前言最早记载的治疗疼痛的一些方法包括使用镇痛药。希波格拉底首次报告了采用柳树皮减轻炎症。1763 年4 月25 日，Edward Stone 向皇家学会致信论述了他针对使用柳树皮药物治疗发烧病人的观察结果。1827 年，Johann Andreas Buchner 首次分离出了柳树皮的活性成份。1829 年，法国化学家Henri Leroux 改进了提取工艺，1897 年，德国化学家Felix Hoffmann 将水杨酸转化为乙酰水杨酸，命名为阿司匹林，从而开启了药理学的新纪元。其它非甾体类抗炎药(NSAID) 从20 世纪50 年代逐渐得到发展。NSAID 是一类具有解热镇痛作用的药物，并且较大剂量时具有抗炎作用。作为镇痛药，NSAID 的独特之处在于不具有催眠作用，因此，它们被用作麻醉剂的非成瘾性替代品。阿司匹林、布洛芬和萘普生是这类药物中最为突出的代表，在大多数国家被作为非处方药使用。对乙酰氨基酚和非那西丁几乎不具有抗炎作用，因此不能视为NSAID。结论通过引入方法开发方案中一般梯度的测量方法可以快速解决分析问题。本应用简报以镇痛药为例，揭示了如何开发具有不同选择性的固定相和使用诸如乙腈和甲醇等有机改性剂，以用于优化分离。在本示例中，发现广泛适用的C18 固定相如Agilent Poroshell 120 EC-C18 柱却无法提供充分的分离。采用另一种选择性色谱柱如Agilent Poroshell 120 PFP 柱可获得更好的结果。由于氟化固定相可以增强与卤素以及共轭化合物的相互作用，因此非常实用。